本发明专利技术公开了ＣＹＰ２Ｃ１９、ＡＢＣＢ１基因ＳＮＰ检测液相芯片及其检测方法，该液相芯片包括有：分别包被有特异的ａｎｔｉ－ｔａｇ序列的微球，所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序列选自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７～ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１２中的序列；针对目的基因ＳＮＰ位点的特异性序列和５’端的ｔａｇ序列组成的３对ＡＳＰＥ引物，特异性序列分别为：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６；扩增引物。所述液相芯片检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及CYP2C19、 ABCB1基因 SNP检测液相芯片及其检测方法。
技术介绍
波立维(Plavix，又称氯吡格雷，Cl叩idogrel)是新一代血小板凝聚抑制剂，于1998 年3月获FDA正式批准上市。它与阿司匹林的联合治疗在急性冠脉综合症和经皮冠状动脉介入 治疗(PCI)患者中得到广泛应用，可以有效预防心肌梗死，中风和血管性死亡。目前，全球 有数以万计的患者在植入冠脉支架后长期服用波立维以预防血栓形成。波立维是一种前体药物，需经过P450酶系代谢形成活性代谢产物。科学研究证明波立维 的疗效存在显著的个体差异，主要是受患者特定的吸收和代谢酶基因多态性(单核苷酸多态 性，SNP)的影响。对波立维药效反应较低的患者，服用该药预防心血管事件的作用将显著减 弱。最近的临床研究进一步证实，波立维的疗效与患者体内两个基因的SNP关系密切，即 CYP2C19和ABCB1。携有两个CYP2C19功能减弱等位基因位点的患者，以及携有一个或一个以上 ABCB1基因变异位点(C3435T)的患者，他们与正常基因型患者相比，在接受相同治疗方案的 情况下发生心血管事件(包括血管性死亡、急性心肌梗塞和中风)的概率增加近50%。因此， 检测患者这两个基因的多态性情况能科学指导波立维的临床使用。CYP2C19是波立维的主要代谢酶，能活化波立维使其产生药效。在中国人群中，CYP2C19常见的两种功能减弱等位基因型为CYP2C19"和CYP2C19"，它们的分布频率分别是29. 7%和 3. 5%。而ABCB1主要影响波立维在肠道的吸收，ABCB1基因C3435T突变型(分布频率约为39. 7 %) 会显著削弱波立维的吸收能力。目前国内外尚未有同时检测波立维两个疗效相关基因——CYP2C19和ABCB1基因多态性的 产品上市。目前国内外能检测CYP2C19基因SNPs的产品，如Amersham Bioscience (GE healthcare)的CodeLink P450, Roche的A即liChip P450等，主要建立在传统固相芯片的基 础上，价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。而其它以PCR为基础的检测SNPs 的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR—单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术 存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量 的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应一限制性片段长度多态(PCR—RFLP)分析 技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一 次只能进行一种突变的检测，耗时费力。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技 术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物 大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光 染色剂，从而形成多至lOO种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物 的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。 这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读 取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测 微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型； 绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既 满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优 点。我们采用xTAG液相芯片技术可以同时检测多种SNPs，实现高通量快速简便化操作，大大 提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供CYP2C19、 ABCB1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测 CYP2C19基因的正常基因型以及两种常见等位基因型CYP2C19W和CYP2C19+3，以及ABCB1基因 的正常基因型和C3435T等位基因的变异。实现上述目的的技术方案如下一种CYP2C19和ABCB1基因SNP检测液相芯片，包括有(1) .分别包被有特异的anti-tag序列的6种微球，每种微球具有不同颜色编码，anti-tag 序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 12中的序列；(2) . 针对每种型别的SNP位点分别设计的3对ASPE引物，每种ASPE引物由3'端的针对目的 基因SNP位点的特异性序列和5'端的tag序列组成，所述tag序列能相应地与(1)中所选 的微球上anti-tag序列互补配对；所述针对目的基因SNP位点的特异性序列分别为SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4、和SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6;(3) . 扩增出分别具有CYP2C19和ABCB1基因SNP位点的目标序列的引物。优选地，所述扩增引物为，针对CYP2C19 Exon5的SEQ ID NO, 13及SEQ ID NO. 14;针对CYP2C19 Exon4的SEQ ID NO. 15及SEQ ID NO. 16;针对ABCB1 Exon26的SEQ ID NO. 17及SEQ ID NO.18。优选地所述3对由tag序列和特界性序列组成的特异ASPE引物为由SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 1组成的ASPE引物，及由SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 2组成的ASPE引物;由SEQ ID NO. 21 和SEQ ID NO. 3组成的ASPE引物，及由SEQ ID NO. 22和SEQ ID NO. 4组成的ASPE引物;由SEQ ID NO. 23和SEQ ID NO. 5组成的ASPE引物，及由SEQ ID NO. 24和SEQ ID NO. 6组成的ASPE引物。本专利技术的另一 目的是提供一种ABCBi基因SNP检测液相芯片。一种ABCB1基因SNP检测液相芯片，主要包括有(1) .分别包被有特异的anti-tag序列的2种微球，每种微球具有不同颜色编码，anti-tag 序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 11 SEQ ID NO. 12中的序列；(2) .针对SNP位点设计的ASPE引物，每种ASPE引物由3'端的针对目的基因SNP位点的特异 性序列和5'端的tag序列组成，所述tag序列能相应地与(1)中所选的微球上anti-tag 序列互补配对；所述针对目的基因SNP位点的特异性序列为SEQ ID NO. 5及SEQ ID NO. 6;(3) .扩增出具有ABCBl基因SNP位点的目标序列的引物。 优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO. 17及SEQ ID NO. 18。 本专利技术的另一目的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＣＹＰ２Ｃ１９和ＡＢＣＢ１基因ＳＮＰ检测液相芯片，其特征是，主要包括有： （１）．分别包被有特异的ａｎｔｉ ｔａｇ序列的６种微球，每种微球具有不同颜色编码，ａｎｔｉ－ｔａｇ序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ａｎｔｉ－ｔａｇ序 列选自ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２中的序列； （２）．针对每种型别的ＳＮＰ位点分别设计的３对ＡＳＰＥ引物，每种ＡＳＰＥ引物由３’端的针对目的基因ＳＮＰ位点的特异性序列和５’端的ｔａｇ序列组成，所述ｔａｇ序列能相应 地与（１）中所选的微球上ａｎｔｉ－ｔａｇ序列互补配对；所述针对目的基因ＳＮＰ位点的特异性序列分别为：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３及ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５及ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ．６； （３）．扩增出分别具有ＣＹＰ２Ｃ１９和ＡＢＣＢ１基因ＳＮＰ位点的目标序列的引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，何嘉英，任立芬，
申请(专利权)人：广州益善生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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