阿托西班和抑制其聚合体杂质生成的方法技术

本发明专利技术涉及阿托西班和抑制其聚合体杂质生成的方法。该方法按照阿托西班主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，包括如下步骤：以Fmoc

【技术实现步骤摘要】
阿托西班和抑制其聚合体杂质生成的方法


[0001]本专利技术属于医药
，涉及一种由9个氨基酸组成的人工合成环状多肽，特别涉及一种用于有需要的妊娠妇女以推迟即将来临的早产的催产素竞争性拮抗剂，尤其是涉及一种阿托西班或其药用盐例如醋酸盐，还涉及该环状多肽的合成方法，尤其是该合成方法能够抑制聚合体尤其是二聚体杂质的生成，以便获得优良化学纯的阿托西班。

技术介绍

[0002]醋酸阿托西班注射液(Atosiban Acetate Injection)最早由Ferring AB(辉凌公司)研发，于2000年首次被EMEA授权上市销售，其商品名为司)研发，于2000年首次被EMEA授权上市销售，其商品名为并于2006年在中国获批上市。目前国内外临床上阿托西班的适应症为：适用于有下列情况的妊娠妇女，以推迟即将来临的早产：每次至少30秒的规律子宫收缩，每30分钟内≥4次；宫颈扩张1
‑
3cm(未经产妇0
‑
3cm)和子宫软化度/变薄≥50％；年龄≥18；妊娠24至33足周；胎心率正常。
[0003]阿托西班是一种催产素类似物，为人工合成的环状多肽，在药品中以醋酸盐的形式存在，是子宫内及胎膜上催产素受体的竞争性拮抗剂，用于治疗早产的唯一具有子宫特异性的宫缩抑制剂，其作用机制是与催产素竞争子宫肌层、胎膜上的催产素受体，减少催产素的功效，减少肌细胞上的钙离子水平，从而抑制子宫收缩。
[0004]阿托西班(Atosiban)的中文化学名称为：1
‑
(3
‑r/>硫醇丙醇酸)
‑2‑
(O
‑
乙基
‑
D
‑
酪氨酸)
‑4‑
L
‑
苏氨酸
‑8‑
L
‑
鸟氨酸
‑
催产素，英文化学名为：1
‑
(3
‑
Mercaptopropanoic acid)
‑2‑
(O
‑
ethyl
‑
D
‑
tyrosine)
‑4‑
L
‑
threonine
‑8‑
L
‑
ornithineoxytocin，CAS登记号：90779
‑
69
‑
4，分子式：C43H67N11O12S2，分子量：994.19，其化学结构式为：
[0005][0006]阿托西班在本领域亦有用如下肽链形式表示：
[0007]或者用如下肽链形式表示：
[0008]c[Mpa
‑
D
‑
Tyr(Et)
‑
Ile
‑
Thr
‑
Asn
‑
Cys]‑
Pro
‑
Orn
‑
Gly
‑
NH2，
[0009]其中3
‑
硫醇丙醇酸与半胱氨酸上的巯基环化形成环状九肽即为终产物阿托西班，其中在通过固相合成法制得未环化的线性九肽树脂后，需要执行环化处理使线性九肽树脂的两个巯基环合。
[0010]制备阿托西班醋酸盐的方法已有诸多文献报道。例如，CN101696236B(申请号200910008880.6)涉及一种固相合成阿托西班方法，包括如下步骤：1)以Rink Amide树脂为载体，脱Fmoc
‑
保护后得到H2N
‑
Rink Amide树脂；2)以HOBT、DIPCI为缩合试剂，将Fmoc
‑
Gly
‑
OH的羧基与树脂氨基相连，得到Fmoc
‑
Gly(树脂)；3)采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸；4)用碘进行固相环化；5)然后用裂解试剂(三氟乙酸/硫代苯甲醚/1,2
‑
乙二硫醇/
水)切割，乙醚沉淀，得到阿托西班粗肽；6)粗品经HPLC制备分离得阿托西班纯品。
[0011]CN101314613B(200810043347.9)涉及一种阿托西班的合成工艺，合成工艺步骤如下：使用氨甲基树脂作载体，按照Fmoc/tbu固相多肽合成的方法将氨基酸逐个连上，再用树脂上碘氧化的方法形成硫硫键，最后再用三氟醋酸：三异丙基硅烷：水：对甲酚的混合溶液将肽从树脂上切下，就能直接得到形成硫硫键的粗品，经制备HPLC纯化冷冻得到阿托西班。
[0012]CN102146121A(201010552213.7)涉及固相合成阿托西班的方法，包括如下步骤：1)以氨基树脂为载体，脱保护；2)将Fmoc
‑
Gly
‑
OH的羧基与树脂的氨基相连，得到Fmoc
‑
Gly
‑
氨基树脂；3)依次固相合成序列剩余保护氨基酸；4)脱除半胱氨酸和巯基丙酸的侧链保护基；5)用碘进行固相环化；6)切割，得到阿托西班粗肽；7)精制，得到阿托西班纯品。
[0013]CN111393508A(申请号202010226143.X)涉及一种阿托西班的制备方法，该制备方法包括针对不同的氨基酸、不同的位点采用不同的缩合剂/活化剂组合：DIC/HOBT、TBTU、TBTU/HOBT、HBTU/HOBT、BOP/HOBT、制备Mpr(Trt)
‑
D
‑
Tyr(OEt)
‑
Ile
‑
Thr(tBu)
‑
Asn(Trt)
‑
Cys(Trt)
‑
Pro
‑
Orn(Boc)
‑
Gly
‑
树脂，然后经切肽、氧化和纯化后获得阿托西班。
[0014]CN114685614A(申请号202011609835.9)公开了一种阿托西班的固相合成方法，包括以下步骤：以Sieber Resin作为起始树脂，合成Fmoc
‑
Gly
‑
Sieber Resin；按照固相合成的方法，依次偶联相应的保护氨基酸或片段，制得阿托西班线性肽树脂，其中第8位氨基酸采用Fmoc
‑
Orn(Dde)
‑
OH；采用水合肼脱除Fmoc
‑
Orn(Dde)
‑
OH的Dde保护，再直接固相氧化，裂解后得到阿托西班。
[0015]CN115461355A(申请号202080099727.3)提供一种制备阿托西班的方法，包括以下步骤：(a)使用Fmoc
‑
Gly
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Rink树脂作为载体，在多肽偶联剂存在下将N端被Fmoc保护的氨基酸逐个偶联至所述Fmoc
‑
Gly
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Rink树脂并逐个进行Fmoc脱保护，从而固相制备线性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备阿托西班的方法，其按照阿托西班主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，包括如下步骤：(i)以Fmoc
‑
rink Amide AM树脂作起始原料，使用HOBT和DIC的混合物作为缩合剂进行接肽反应，依次连接Fmoc
‑
Gly
‑
OH、Fmoc
‑
Orn(Boc)
‑
OH、Fmoc
‑
Pro
‑
OH、Fmoc
‑
Cys(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Asn(Trt)
‑
OH、Fmoc
‑
Thr(tBu)
‑
OH、Fmoc
‑
Ile
‑
OH、Fmoc
‑
D
‑
Tyr(Et)
‑
OH、Mpr(Trt)
‑
OH，在每次接肽反应连接之前依次使用脱帽试剂脱去芴甲氧羰基，得到线性阿托西班树脂；(ii)向线性阿托西班树脂中加入碘进行氧化反应，使第1位Mpa和第6位Cys形成二硫键得到环化阿托西班树脂；(iii)向所得环化阿托西班树脂中加入裂解试剂进行裂解，分离获得阿托西班；任选的，(iv)使用制备型液相色谱法对阿托西班粗品进行纯化，得到精制的阿托西班。2.根据权利要求1的方法，其中所用的脱帽试剂为30％的哌啶/DMF。3.根据权利要求1的方法，其中所用的脱帽试剂用量为：其与树脂的投料比例为4～6ml/g树脂，例如5～5.5ml/g树脂。4.根据权利要求1的方法，其中脱帽反应的条件为40～50℃反应20～30分钟，例如45℃脱帽反应25分钟。5.根据权利要求1的方法，其中：接肽反应中所用的接肽试剂为DMF；每一步接肽反应中所用的Fmoc
‑
保护氨基酸的量是树脂量的2～4倍，例如是树脂量的3倍；最后一步接肽反应中所用的氨基酸的量是树脂量的4～5倍，例如是树脂量的4倍；接肽反应中，所用的HOBT的摩尔数均为树脂的2～5倍例如3～4倍，例如在接入第1～8个氨基酸时HOBT的摩尔数均为树脂的3倍，例如在接入第9个氨基酸时HOBT的摩尔数均为树脂的4倍；DIC的摩尔数为树脂的2～6倍例如3～5倍，例如在接入第1～8个氨基酸时DIC的摩尔数为树脂的3.6倍，在接入第9个氨基酸时DIC的摩尔数为树脂的4.8倍；和/或接肽反应的温度为25～35℃例如30℃，在接入第1个氨基酸时反应24小时，在接入后续氨基酸时反应1～2小时例如反应1.5小时。6.根据权利要求1的方法，其中，环化反应所用碘的摩尔量为树脂的5～10倍例如8倍；例如，环化反应所用溶剂是DMF，例如每1g碘使用该溶剂的量20～50ml，例如25～35ml，例如约31ml；例如，环化反应所用溶剂是丙酮，例如每1g碘使用丙酮的量20～50ml，例如25～35ml，例如约31ml；例如，环化反应所用溶剂是丙酮并且其中还添加甲酸，每1g碘使用丙酮的量20～50ml，例如25～35ml，例如约31ml；例如，丙酮与甲酸的体积比为200:0.5～2，例如体积比为200:1；例如，环化反应是在氮气吹搅反应20～60min例如反应30min；例如，环化反应完毕后用依次用DMF、DCM和甲醇洗涤，例如每种溶剂洗涤3次；例如洗涤完毕后真空干燥；例如，按如下操作进行环化反应：以80mmol树脂投料计，称取162.6g碘加入5000ml丙酮和25ml甲酸的混合液中搅拌溶解，完全溶解后加入到反应釜内，氮气吹搅反应30mi n；反应完毕后，抽去反应液，用DMF以3000ml/次洗涤3次，再用DCM以3000ml/次洗涤3次，最后用甲醇3000ml/次洗涤3次，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h，得环化阿托西班树脂。7.根据权利要求1的方法，其中：
使用三氟乙酸、硫代苯甲醚、1,2
‑
乙二硫醇、水的混合液作为切肽试剂(裂解试剂)进行切肽反应(裂解反应)；切肽试剂是三氟乙酸：硫代苯甲醚：1,2
‑
乙二硫醇：水＝90：5：3：2的混合液；切肽反应条件为，30～40℃切肽反应1～3小时，例如32℃切肽反应2小时；切肽反应所得沉淀物用乙醚进行沉淀和洗涤，干燥后得到阿托西班粗品。8.根据权利要求1的方法，其中：使用制备型C18柱进行纯化；制备型C18柱纯化所用流动相A为0.3％醋酸水溶液，流动相B为乙腈；洗脱程序为：0～10min维持流动相B5％，10～11min流动相B增加至35％，11～70min流动相B线性增加至45％，70～71min流动相B增加至50％，71～75min维持流动相B50％；其是按照包括如下步骤的方法制备得到的：(1)制备Fmoc
‑
Gly
‑
树脂：将80mmol的Fmoc
‑
rink Amide AM树脂加入到合成反应釜中，加入DCM洗涤、再加入DMF洗涤，向反应釜内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，茚三酮检测应呈阳性；称取240mmol的Fmoc
‑
Gly
‑
OH和240mmol的HOBT，加入N,N
‑
二甲基甲酰胺搅拌溶解，完全溶解后加入1mol/L的DIC/DMF溶液290ml，搅拌均匀后加入到反应釜内，搅拌反应24小时，反应完毕后，抽去反应液，用DMF洗涤3次，再用DCM洗涤，最后用甲醇洗涤，抽干，倒出，放入真空干燥箱干燥12h，得Fmoc
‑
Gly
‑
树脂；(2)制备Fmoc
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Orn(Boc)
‑
Gly
‑
树脂：将上一步骤所得Fmoc
‑
Gly
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树脂加入到反应釜中，加入DCM洗涤、再加入DMF洗涤；向反应釜内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，茚三酮检测应呈阳性；称取240mmol的Fmoc
‑
Orn(Boc)
‑
OH及240mmol的HOBT，加入DMF(400～500ml)搅拌溶解，完全溶解后加入1mol/L的DIC的DMF溶液290ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应釜内，搅拌反应90min后，抽去反应液，用DMF洗涤，抽干，得标题树脂；(3)制备Fmoc
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Pro
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Orn(Boc)
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Gly
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树脂：向反应釜内加入配置好的30％的哌啶/DMF溶液550ml，搅拌反应30min，抽除反应液，加入DMF洗涤，茚三酮检测应呈阳性；称取240mmol的Fmoc
‑
Pro
‑
OH及240mmol的HOBT，加入DMF(400～500ml)搅拌溶解，完全溶解后加入1mol/L的DIC的DMF溶液290ml，搅拌均匀；将配制好的氨基酸偶联液加入到反应釜内，搅拌反应9...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋名更，万丽娟，杨勇，黄振福，谢开罗，程云英，陈超，赵东明，
申请(专利权)人：海南中和药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：