一种维拉卡肽杂质的制备方法技术

本发明专利技术公开了5个维拉卡肽杂质的制备方法。5个杂质肽序结构分别为：杂质I：D‑Cys(Cys)‑D‑Ala‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Ala‑D‑Arg‑NH

【技术实现步骤摘要】
一种维拉卡肽杂质的制备方法
本专利技术涉及一种活性多肽药物的杂质及其制备方法，尤其涉及杂质的制备方法。
技术介绍
维拉卡肽(Etelcalcetide)是由AMGMNINC开发的一种新颖的拟钙剂，主要用于慢性肾病成人患者做血液透析治疗的继发性甲状旁腺功能亢进的多肽药物。2017年2月07日在美国上市，商品名为Parsabiv。临床数据表明维拉卡肽用于继发性甲状旁腺机能亢进时在降低甲状旁腺素水平方面与西那卡塞一样好，并且因其可在血液透析后静脉给药，优于现有的标准拟钙剂治疗药西那卡塞。维拉卡肽主链由7个氨基酸组成，但均为非天然氨基酸D-型氨基酸，分别为4个D-Arg、2个D-Ala和1个D-Cys，侧链通过二硫键与L-半胱氨酸相连。维拉卡肽的肽序结构如下所示：维拉卡肽肽序结构中含C端酰胺和N端乙酰基结构，在原料药生产和储存过程中可能水解产生杂质[Des-Ac]-维拉卡肽(杂质I)和[Arg7-OH]-维拉卡肽(杂质II)。维拉卡肽肽序结构通过二硫键将主链和L-Cys连接，在原料药生产和储存过程中可能发生过氧化而产生杂质[D-Cys(Cys(S＝O))]-维拉卡肽(杂质III)、[D-Cys1(S＝O)]-维拉卡肽(杂质IV)；同时，可能发生二硫键错配、聚合进而产生二聚体(杂质V)和胱氨酸(杂质VI)。杂质研究是药物质量研究的一项重要内容，是药物质量保证的关键因素之一。为了提高临床用药安全，需对合成过程中产生的工艺杂质和储存过程中产生的降解杂质进行详细的研究。由于维拉卡肽化学结构特性，其在储存过程中可能产生降解杂质，而这些杂质可能引起过敏反应、毒性及其他不良反应。因此，需对维拉卡肽潜在的降解杂质进行定向的合成制备，用于维拉卡肽原料药和维拉卡肽注射液的质量研究，从而有效地保障和控制维拉卡肽的质量，为安全用药提供重要的指导意义。
技术实现思路
本专利技术所需解决的技术问题是提供一种维拉卡肽杂质的制备方法，该方法操作简单，所得杂质纯度高，能作为杂质对照品用于维拉卡肽原料药及制剂的质量研究，从而有效地保障和控制维拉卡肽产品的质量。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：维拉卡肽杂质为杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]和杂质V[二聚体]，其肽序结构分别为：杂质I[Des-Ac]：D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；杂质II[Arg7-OH]：Ac-D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH；杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]：Ac-D-Cys(Cys(S＝O))-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；杂质IV[D-Cys1(S＝O)]：Ac-D-Cys(S＝O)(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；杂质V[二聚体]：本专利技术还提供了上述杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]和杂质V[二聚体]的制备方法。具体地说，本专利技术所述的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的制备方法包括如下步骤：1)以RinkAmideAM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与RinkAmideAM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-RinkAmideAM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，即可得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-RinkAmideAM树脂；2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质I粗肽溶液；3)用反相高效液相色谱法纯化分离、再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]。进一步，步骤1)所述的RinkAmideAM树脂的取代值为0.5～1.2mmol/g，优选0.8～1.0mmol/g；步骤2)中所述的裂解试剂为：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2；液相氧化反应时溶液pH值的范围为5.0～9.0，优选6.5～8.0，进一步优选为7.0～8.0。步骤3)中所述的反相高效液相色谱法纯化分离时，采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。采用本专利技术的方法制得的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的HPLC纯度达到96％以上，经结构确认和标定后可作为杂质对照品，用于维拉卡肽原料药和制剂的质量研究。本专利技术所述的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]的制备方法，包括如下步骤：1)以Wang树脂为起始物料，溶胀后以DIC/HOBt为缩合试剂，以DMAP为催化剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Wang树脂上的羟基形成酯键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-OH-Wang树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联moc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Wang树脂；2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.维拉卡肽杂质，其特征在于，所述的维拉卡肽杂质为杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg

【技术特征摘要】
1.维拉卡肽杂质，其特征在于，所述的维拉卡肽杂质为杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]、和杂质V[二聚体]，其肽序结构分别为：
杂质I：D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质II：Ac-D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH；
杂质III：Ac-D-Cys(Cys(S＝O))-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质IV：Ac-D-Cys(S＝O)(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质V：


2.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的制备方法包括如下步骤：
1)以RinkAmideAM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与RinkAmideAM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-RinkAmideAM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，即可得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-RinkAmideAM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到维拉卡肽杂质I直链肽肽：D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质I粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离、再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]。


3.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]的制备方法包括如下步骤：
1)以Wang树脂为起始物料，溶胀后以DIC/HOBt为缩合试剂，以DMAP为催化剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Wang树脂上的羟基形成酯键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-OH-Wang树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联moc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Wang树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质II粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离、再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]。


4.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的制备方法包括如下步骤：
1)以RinkAmideAM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与RinkAmideAM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-RinkAmideAM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-RinkAmideAM树脂，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化，得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-RinkAmideAM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈超，周良，凌振宏，云晓，
申请(专利权)人：海南中和药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46