一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法技术

本发明专利技术涉及生物试剂技术领域，具体涉及到一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法。所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK；所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK；所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK。从SH中分离的对细胞生长有促进作用的P1、LC组分中，含有6种共有肽段，这6个肽段是大豆蛋白水解物中对动物细胞起促生长作用的重要肽段。打破大豆蛋白水解物国外技术垄断，时可作为无血清培养基添加物应用于实际生产。

【技术实现步骤摘要】
一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法
本专利技术涉及生物试剂
，具体涉及到一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法。
技术介绍
随着生物制药技术的飞速发展，用于疫苗生产的动物细胞培养迫切需要无动物源性成分的无血清培养基，相继开发出多种植物蛋白水解物应用于无血清培养基中。大豆蛋白来源广泛，经水解后能为动物细胞生长提供所需的多种必需氨基酸、非必需氨基酸和多肽，而这些多肽可能是用于动物细胞无血清培养基的添加物。我国无血清培养基及蛋白水解产物的应用研究相对滞后，国内无血清培养基添加的蛋白水解物主要依赖进口，目前的研究大多集中于对不同蛋白的水解工艺探索。但是还并没有能够打破大豆蛋白水解物国外技术垄断，作为无血清培养基添加物应用于实际生产。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术优化大豆蛋白水解物制备工艺的同时，通过分离纯化的方法获得了不同特性组分，应用于MDCK悬浮细胞培养，通过检测鉴定寻找到6种肽段，这6种肽段是促细胞增殖的主要肽段。突破了大豆蛋白水解物依赖进口的技术瓶颈，同时为无血清培养基的开发找到新思路。具体的，本专利技术的第一方面提供了一种大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK；所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK；所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK。作为本专利技术一种优选的技术方案，所述添加物中还包含多肽Ⅳ，所述多肽Ⅳ具有如下氨基酸序列：LTEVGPDDDEK。作为本专利技术一种优选的技术方案，所述添加物中还包含多肽Ⅴ，所述多肽Ⅴ具有如下氨基酸序列：GPTVTDPNTEK。作为本专利技术一种优选的技术方案，所述添加物中还包含多肽Ⅵ，所述多肽Ⅵ具有如下氨基酸序列：EEQEWPR。本专利技术的第二个方面提供了如上所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其包括如下步骤：(1)取大豆蛋白粉置于反应釜，并加入纯水搅拌溶解得到8～12wt％的底物溶液；(2)在上述反应釜中加入胰酶，充分搅拌，然后调节体系的pH值至碱性7.5～8.5，调节体系的温度至40～60℃，搅拌条件下反应3～5小时得到酶解液；(3)将上述酶解液升温至95℃以上，维持10～30min，冷却至室温，然后在3000～4000rpm离心15～45min，收集上清液，然后进行后处理即得。作为本专利技术一种优选的技术方案，所述胰酶的体积用量与大豆蛋白粉质量用量比例为a：1，其中a不低于900。作为本专利技术一种优选的技术方案，所述后处理包括超滤、干燥、凝胶过滤层析和离子交换层析步骤；所述超滤步骤中采用的超滤膜孔径不高于20纳米。作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤2中，体系的pH值为7.5～8.5。本专利技术的第三个方面提供了如上所述的方法制备得到的大豆蛋白水解添加物的应用，应用于无血清培养基细胞培养。作为本专利技术一种优选的技术方案，所述无血清培养基细胞培养中所述大豆蛋白水解添加物的用量为1.5～4.5g/L。有益效果：本专利技术建立了大豆蛋白水解物制备的最佳工艺参数：E/S＝1800:1，pH8.0，水解温度50℃，水解时间4h。在此条件下，大豆蛋白的水解度最高，可达37.86％。本研究制备的大豆蛋白水解物SH促MDCK悬浮细胞增殖的效果与进口的1510、S204效果基本一致；SH的最佳添加浓度为2.5g/L；SH不同组分中，P1、LC对细胞有促生长作用，P2促细胞生长作用不明显，而P3、XT对细胞生长有抑制作用。从SH中分离的对细胞生长有促进作用的P1、LC组分中，含有6种共有肽段：分别是IMENQSEELEEKQK、IMENQSEELEEK、KLQGENEEEEK、LTEVGPDDDEK、GPTVTDPNTEK和EEQEWPR，这6个肽段是大豆蛋白水解物中对动物细胞起促生长作用的重要肽段。打破大豆蛋白水解物国外技术垄断，时可作为无血清培养基添加物应用于实际生产。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为时间对大豆蛋白水解度影响实验结果图。图2为酶与底物比对大豆蛋白水解度影响实验结果图。图3为pH值对大豆蛋白水解度影响实验结果图。图4为温度为大豆蛋白水解度影响实验结果图。图5为大豆蛋白水解物SH的凝胶过滤层析试验结果图。图6为大豆蛋白水解物SH的离子交换层析试验结果。图7为细胞连续传代培养的形态观察，其中A为商品化1510组，B为本申请大豆蛋白水解物SH组，C为商品化S204组，D为空白组。图8为细胞连续传代培养第3代细胞生长特性分析结果图。图9为细胞连续传代培养第7代细胞生长特性分析结果图。图10为细胞连续传代培养第11代细胞生长特性分析结果图。图11为细胞连续传代培养第15代细胞生长特性分析结果图。图12为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分第3代细胞生长曲线图。图13为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分第7代细胞生长曲线图。图14为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分第9代细胞生长曲线图。图15为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分第3代细胞生长曲线图，其中流穿即为LC，洗脱即为XT。图16为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分第7代细胞生长曲线图。图17为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分第9代细胞生长曲线图。图18为大豆蛋白水解物SH的SDS-PAGE凝胶电泳结果图。图19为大豆蛋白水解物SH的高效液相色谱结果图。图20为商品化1510的高效液相色谱结果图。图21为商品化S204的高效液相色谱结果图。图22为大豆蛋白水解物SH的液相色谱-串联质谱分析结果图。图23为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分P1的液相色谱-串联质谱分析结果图。图24为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分P2的液相色谱-串联质谱分析结果图。图25为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分P3的液相色谱-串联质谱分析结果图。图26为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分LC的液相色谱-串联质谱分析结果图。图27为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分XT的液相色谱-串联质谱分析结果图。具体实施方式参选以下本专利技术的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本专利技术的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；/n所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK；/n所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK；/n所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK。/n

【技术特征摘要】
1.一种大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；
所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK；
所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK；
所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK。


2.根据权利要求1所述的大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中还包含多肽Ⅳ，所述多肽Ⅳ具有如下氨基酸序列：LTEVGPDDDEK。


3.根据权利要求1所述的大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中还包含多肽Ⅴ，所述多肽Ⅴ具有如下氨基酸序列：GPTVTDPNTEK。


4.根据权利要求1所述的大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中还包含多肽Ⅵ，所述多肽Ⅵ具有如下氨基酸序列：EEQEWPR。


5.根据权利要求1～4任意一项所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)取大豆蛋白粉置于反应釜，并加入纯水搅拌溶解得到8～12wt％的底物溶液；
(2)在上述反应釜中加入胰酶，充分搅拌，然后调节体系的pH值至碱性7.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁功涛，摆倩文，张邵博，马忠仁，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62