本发明专利技术属于医药生物技术领域，具体涉及Ｌ－色氨酸酶法转化制备方法。该制备方法采用含有Ｌ－丝氨酸的混合氨基酸作为原料，将具有高活力Ｌ－色氨酸合成酶或Ｌ－色氨酸酶的基因工程菌与含有Ｌ－丝氨酸的混合氨基酸转化液混合，３０～４５℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度Ｌ－色氨酸。该方法解决了混合氨基酸中Ｌ－丝氨酸的分离及综合开发难题，得到了应用更为广泛、附加值较高的Ｌ－色氨酸产品，具有原料来源广、价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物
，具体涉及L-色氨酸的酶法转化制备方法。二
技术介绍
色氨酸(tryptophan),又名a-氨基-p-吲哚丙酸，是Hopkins和Cole在1902 年发现并分离到的一种氨基酸。它有D-和L-型两种异构体，天然存在的只有L-色氨酸。L-色氨酸对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要作用，因此被广泛 用于医药、食品和饲料等领域。根据目前文献报导L-色氨酸的制备方法主要有以下三种1、 发酵法发酵法生产L-色氨酸大体上可以分为直接发酵法和前体添加发酵法。 直接发酵法中常用的L-色氨酸产生菌有谷氨酸棒杆菌，黄色短杆菌，枯 草杆菌，北京棒杆菌等。如Fukui (JP 1974，20:391)等由枯草杆菌选育的5-氟色 氨酸(5-FT)抗性变异株，可积累L-色氨酸9.6g/L。 Nakayama等(JP 1982， 5:694) 进一步改造变异株，使其具有5-FT和8-氮鸟嘌呤(8-AG)双重抗性，连续流加 邻氨基苯甲酸，可积累L-色氨酸15.6g/L。 Oikawa等人UP2000342294， 2000) 专利技术一种以乳酸为起始原料生产L-色氨酸的方法，即先将乳酸氧化为丙酮酸， 再与d引哚和铵离子反应得L-色氨酸。Hatakeyama等人(US 5776740, 1998)采 用一步法生产L-色氨酸，即在含有甘氨酸、甲醛、吲哚和具丝氨酸羟甲基转移 酶的微生物细胞水溶液中合成L-色氨酸。目前，体内和体外的遗传操作技术已 经用于新型色氨酸产生菌的选育。2、 酶转化法酶促转化法具有终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，它 是廉价生产L-色氨酸最为有效的方法。国内外研究者构建并筛选了高产L-色氨 酸酶和L-色氨酸合成酶基因工程菌，为用酶工程技术生产L-色氨酸奠定了基础。 在氨基酸主要生产国日本，几家大公司如三井东压、三菱油化和三乐等均采用酶 促转化法生产L-色氨酸。据文献报道(日经生物技术，1987， (1): 8)日本三 乐公司克隆了大肠杆菌色氨酸合成酶基因和丝氨酸羟甲基转移酶(SHTase)基因，用甘氨酸为原料合成L-丝氨酸，再加入吲哚生产色氨酸，产量为90g/L。Ishiwata等采用化学法合成DL-丝氨酸，用恶臭假单孢菌消旋酶将D-丝氨 酸转型为L型，加上底物吲哚，用大肠杆菌色氨酸合成酶进行酶促转化，产色 氨酸为110g/L。 Yukawa等(Process Biotech.， 1987,(12):165)构建了带有色氨酸 合成酶基因的大肠杆菌K-12，酶促转化L-丝氨酸和吲哚得L-色氨酸200g/L。 Genex公司Hamilton等(Trends in Biotechnology, 1985,8(3):64-68)克隆了色氨酸 酶基因，以L-丝氨酸和吲哚为底物酶促转化产L-色氨酸200g/L。国内韦平和等(中国现代应用药学杂志，1999， 16 (6): 37-39)利用PCR 技术扩增了 JM105色氨酸酶基因，构建色氨酸酶基因工程菌WW-4，以L-丝氨 酸和吲哚为底物酶促转化产L-色氨酸49g/L， L-丝氨酸转化率为84.2%，吲哚转 化率为93.6%。张绪梅等(生物技术通讯，2006， 17 (1): 12-14)构建色氨酸 合成酶基因工程菌BA3，其色氨酸合成酶活性是对照菌的3.7倍。 3、化学合成法色氨酸的化学合成途径很多，主要有以吲哚为原料及在合成过程中生成吲哚 环两大类(氨基酸杂志，1983, 4: 29-33)。但上述二种方法合成色氨酸或合成 路线长、或需采用价格昂贵的特殊原料、或构建吲哚环的路线反应步骤多，涉及 原料多，工艺条件较苛刻，操作难度大，而不适合大规模工业化生产。
技术实现思路
本专利技术需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-色氨酸的方法。目前，在我国氨基酸生产领域和食品发酵等工业生产过程中，副产品为大量 不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的混合氨基酸，而该混合氨基酸 直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低。本专利技术采用富含L-丝氨酸的混合氨基 酸作为酶法制备L-色氨酸的原料，反应条件温和，色氨酸合成酶或色氨酸酶专 一性强，转化率高，可以达到转化L-丝氨酸为易于分离的L-色氨酸的目的，实 现了工业副产品的综合利用，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。本专利技术可以通过以下技术方案来达到L-色氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为(1)色氨酸合成酶或色氨酸酶的基因工程菌菌株(BA3或WW-4)，在含有 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG， Sigma公司)或乳糖的培养基中培养，诱导产生高5活力的色氨酸合成酶或色氨酸酶；(2) 采用游离细胞法，将含酶细胞和富含L-丝氨酸的混合氨基酸转化液混 合后，再加入缓冲液和表面活性剂，在30 45。C条件下进行酶促转化反应。(3) 将反应生成物进行分离，得到高纯度的L-色氨酸。上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和乳糖， 其浓度为l 20g/L，氮源采用有机氮源，如牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、 豆饼水解液和/或蛋白质水解物，其浓度为1 30g/L,加入IPTG或乳糖诱导， 其浓度为0.05 10g/L。上述步骤(2)的转化液缓冲体系为磷酸缓冲液、硼酸缓冲液和碳酸缓冲 液，使转化液pH7.5 9.5，最适转化液pH8 9;在转化液中加入表面活性剂， 如吐温-80，十六烷三甲基溴化铵(CTAB)，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓 度为0.005 5 g/L。上述步骤(3)中分离反应体系中L-色氨酸的方法是采用等电点结晶法或等 电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。 本专利技术与现有技术相比具有如下优点(1) 本专利技术采用色氨酸合成酶或色氨酸酶的基因工程菌(BA3或WW-4) 在优选的培养基中培养可以高产率的生成色氨酸合成酶或色氨酸酶，使反应有非 常高的转化率和反应速率，L-丝氨酸摩尔转化率达到82°/。以上。(2) 本专利技术采用富含L-丝氨酸的混合氨基酸作为制备原料，反应条件温和， 色氨酸合成酶或色氨酸酶专一性强，转化率高，充分利用了工业副产物，解决了 L-丝氨酸高效分离的难题，具有良好的经济效益和环境效益。(3) L-色氨酸和混合氨基酸中的其它氨基酸理化性质差异很大，用简单的 等电点方法就可以分离制备，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。(4) 具有原料来源丰富，价格低廉，转化时间短，操作简便，生产成本低 等优点。四具体实施方式 实施例一角蛋白来源L-丝氨酸酶法转化制备L-色氨酸方法，其制备步骤如下1.将色氨酸合成酶基因工程菌株培养在如下1000 ml培养基(g/ml)中玉米浆0.5%， NaCl 0.5%， KH2P04 0.16%， MgS04.7H20 0.04%， FeS04.7H20 0.01%，牛肉膏2%，麦芽糖0.5%，葡萄糖0.5%， IPTG0.005%, pH7.2。 37。C摇 瓶振荡培养12h， 4000rpm离心15min得湿细胞25g。2. 将湿细胞加入到0.1mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.5)配制的600ml转化液 中，转化液为含3.8。/。L-丝氨酸(g/ml)的羽毛酸水解液(氨基酸总含量15%)、 22.8g n引哚和0.05% OP溶液(g/ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ｌ－色氨酸的酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成： （１）具有高活力Ｌ－色氨酸合成酶或Ｌ－色氨酸酶的基因工程菌，在含有ＩＰＴＧ或乳糖的培养基中培养，产生高活力的Ｌ－色氨酸合成酶或Ｌ－色氨酸酶； （２）用游离细胞法，将含酶 细胞和含有Ｌ－丝氨酸的混合氨基酸的转化液混合后，再加入缓冲液、适量的磷酸吡哆醛和表面活性剂，在３０～４５℃条件下进行酶促反应，将反应生成物进行分离，得到高纯度的Ｌ－色氨酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：焦庆才，赵根海，刘均忠，张飞，刘茜，肖国安，王先兵，曾庆群，
申请(专利权)人：南京大学，湖北新生源生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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