一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母及在提高柠檬加工废水澄清度中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母及在提高柠檬加工废水澄清度中的应用，本发明专利技术以将源自黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶裂解酶基因pelD为目的基因，构建重组质粒pPIC9K

【技术实现步骤摘要】
一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母及在提高柠檬加工废水澄清度中的应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母及在提高柠檬加工废水澄清度中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]果胶裂解酶(pectin lyase)是一种可直接作用于高度甲酯化果胶的果胶酶，通过反式消去方式在果胶C
‑
4位置处断裂糖苷键，同时从C
‑
5处消去一个氢原子，生成含不饱和键的产物。果胶裂解酶来源十分广泛，普遍存在于微生物和植物中，也有极少数动物可以产生。细菌和真菌是果胶裂解酶的主要来源，如曲霉属、青霉属、欧文氏菌、芽孢杆菌等。根据其作用模式的不同，可将果胶裂解酶细分为：内切果胶裂解酶和外切果胶裂解酶；而根据其pH适应性的不同，可分为酸性果胶裂解酶和碱性果胶裂解酶。果胶裂解酶广泛地应用于食品工业、纺织工业、造纸业、含果胶类物质的污水处理等。
[0003]对于果胶裂解酶来说，由于其来源比较广泛，主要由真菌和细菌产生，如曲霉属、青霉属、欧文氏杆菌、芽孢杆菌等等，其目前主要的蛋白重组表达系统有原核和真核两大类，常用表达宿主有大肠杆菌(原核)、芽孢杆菌(原核)、酿酒酵母(真核)、毕赤酵母(真核)以及曲霉属(真核)。一般来说，原核重组表达系统具有生长周期短、转化方法简便且效率高等优势，其缺点是无法对重组蛋白进行翻译后修饰、且易形成包涵体导致蛋白纯化困难和无生物活性等问题。酵母表达系统，最常用的为巴斯德毕赤酵母，该蛋白重组表达系统具有生长周期短、可对重组蛋白进行一定的翻译后修饰，易放大生产(高密度发酵)等优点，目前是表达重组蛋白最常用的表达系统。
[0004]毕赤酵母表达的蛋白具有良好的生物活性，该系统可对蛋白进行糖基化，磷酸化等修饰。毕赤酵母发酵控制简易，蛋白产量和纯度高，利于后期蛋白纯化，另外甲醇诱导较IPTG成本更低，且适于大规模高密度发酵，甲醇在一定程度上可以避免杂菌污染，另外它代替葡萄糖等碳源，也可节省成本。
[0005]柠檬废水是由废弃柠檬果皮煮沸提取而来，可以用于提取果胶和生产果汁，具有一定商业价值。但由于柠檬废水中含有大量果胶和纤维素等物质，对于果汁的口感和澄清度有一定影响。近年来人们通过使用酶处理法，添加果胶酶来解决果汁生产中的问题。在果汁生产过程中添加果胶酶能够有效的降低果浆粘稠度，果汁的产量会大幅增加，比传统的机械方法相比不仅所得果汁产量增加，果汁的感官得到改善而且更多水果中的营养物质得以保留，但是果汁的澄清度欠佳。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母及在提高柠檬加工废水澄清度中的应用，将源自黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶裂解酶基因在毕赤酵母(pichia pastoris)中进行表达，构建得到重组毕赤酵母菌株，能有效提高果胶裂解酶的表
达量，作用于柠檬废水，提高了柠檬废水的澄清度和还原糖含量，使其可应用于果汁生产和啤酒发酵等方面的应用；选择毕赤酵母进行果胶裂解酶的异源表达，成本更低，后期发酵产酶条件相较黑曲霉发酵产酶更成熟和简单，更利于放大生产。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]本专利技术提供一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是将果胶裂解酶基因转入宿主毕赤酵母获得的；所述果胶裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。所述毕赤酵母优选为毕赤酵母(pichia pastoris)GS115。
[0009]优选的，所述重组毕赤酵母按如下方法构建：在果胶裂解酶基因的N端连接Kozak序列和His
‑
Tag序列后，通过一步克隆法连接至质粒pPIC9K，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒pPIC9K
‑
pelD，并用QuickcutSal I限制性内切酶线性化后，电转毕赤酵母，获得重组毕赤酵母。
[0010]本专利技术还提供一种所述重组毕赤酵母在提高柠檬加工废水澄清度中的应用，所述的应用为：将重组毕赤酵母发酵培养液离心获得的上清液提取的重组果胶裂解酶纯酶，加入柠檬加工废水中，在30
‑
50℃恒温水浴锅中反应40
‑
80min(优选在40℃恒温水浴锅中反应60min)，获得澄清度和还原糖含量提高的柠檬水。所述柠檬加工废水是将废弃的柠檬果皮切碎，加入蒸馏水中，在80℃浸提4
‑
5h，过滤，收集滤液得到柠檬废水；所述蒸馏水体积用量以柠檬果皮质量计为2
‑
7mL/g，优选5mL/g。
[0011]优选的，所述纯酶加入柠檬加工废水中的体积浓度为0.4
‑
0.5％，优选0.45％。所述纯酶酶活为1
‑
5U/ml，优选2.454U/ml。
[0012]优选的，所述纯酶按如下方法制备：(1)将重组毕赤酵母(优选GS115/pPIC9K
‑
pelD)接种至BMGY液体培养基中，于30℃摇床培养16
‑
18h至OD
600
＝2
‑
6；无菌条件下4000rpm离心5min，菌体转接于BMMY液体培养基，每隔12h向培养基中无菌注射甲醇至体积终浓度为1％，30℃、200rpm摇床发酵培养72h，12000rpm离心5min，上清液(即为粗酶液)；
[0013](2)取上清液通过Ni
‑
NTA亲和层析柱纯化，收集含有目的蛋白的洗脱液，即为重组果胶裂解酶纯酶，所述Ni
‑
NTA亲和层析柱纯化方法为：Ni
‑
NTA亲和层析柱用含有20mM咪唑的pH7.2PB缓冲液平衡后，将粗酶液以流速2mL/min上样，上样结束后再用含有20mM咪唑的pH7.2PB缓冲液洗平基线，最后用含200mM咪唑的pH7.2PB缓冲液以流速2mL/min洗脱目的蛋白，当UV280nm值大于200mAU时收集含有目的蛋白的洗脱液，当UV280nm值下降到小于200mAU停止收集，获得重组果胶裂解酶纯酶。
[0014]与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术构建了一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母，通过发酵生产的果胶裂解酶纯酶作用于柠檬加工废水，提高了柠檬加工废水的澄清度和还原糖含量，澄清度达到88.87％，还原糖含量2.06mg/2mL废水。经本专利技术果胶裂解酶纯酶处理后的柠檬废水，可应用于果汁生产，提高果汁的澄清度和口感，也可以应用于啤酒发酵，提高了发酵糖的含量，进一步提升发酵效率。
(四)附图说明
[0015]图1为实施例1果胶裂解酶pelD基因片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；M：Marker；泳道1：果胶裂解酶pelD基因。
[0016]图2为实施例2添加Kozak序列和His
‑
Tag的果胶裂解酶pelD基因琼脂糖凝胶电泳图；M：Marker；泳道1：携带Kozak序列和His
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产果胶裂解酶的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母是将果胶裂解酶基因转入宿主毕赤酵母获得的；所述果胶裂解酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.如权利要求1所述所述重组毕赤酵母，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母(pichia pastoris)GS115。3.如权利要求1所述所述重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母按如下方法构建：在果胶裂解酶基因的N端连接Kozak序列和His
‑
Tag序列后，通过一步克隆法连接至质粒pPIC9K，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒pPIC9K
‑
pelD，并用QuickcutSal I限制性内切酶线性化后，电转毕赤酵母，获得重组毕赤酵母。4.一种权利要求1所述重组毕赤酵母在提高柠檬废水澄清度中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将重组毕赤酵母发酵培养液离心获得的上清液提取的重组果胶裂解酶纯酶，加入柠檬废水中，在30
‑
50℃恒温水浴锅中反应40
‑
80min，获得澄清度和还原糖含量提高的柠檬水。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述柠檬废水是将废弃的柠檬果皮切碎，加入蒸馏水中，在80℃浸提4
‑
5h，过滤，收集滤液得到柠檬废水。7.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：章银军，谢添莉，褚盈雁，童美君，汪钊，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：