乙型肝炎疫苗及其生产方法技术

本公开涉及一种诱导乙肝表面抗原表达的方法、乙肝表面抗原纯化的方法、生产乙型肝炎疫苗的方法和乙型肝炎疫苗。该诱导乙肝表面抗原表达的方法：将表达乙肝表面抗原的酵母进行三级发酵至OD

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎疫苗及其生产方法


[0001]本公开属于生物制药
，具体涉及一种诱导乙肝表面抗原表达的方法、乙肝表面抗原纯化的方法、生产乙型肝炎疫苗的方法和乙型肝炎疫苗。

技术介绍

[0002]乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA型病毒，基因组为3.2KB的双链DNA分子，可以通过血液或其它体液传播的方式进行感染。乙型肝炎病毒可以在体外存活至少7天。在此期间，如果乙型肝炎病毒侵入到没有接种疫苗的个体，该个体很可能会感染。乙型肝炎病毒的潜伏期为30到180天。
[0003]HBV是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化，进而引发乙型肝炎(俗称乙肝)。乙肝病毒可在感染后30至60天内被检测到，并可持续存在并发展成慢性乙型肝炎，尤其是在婴儿或儿童阶段感染，慢性乙肝可能会发展成为肝硬化甚至肝癌。
[0004]世界卫生组织(WHO)明确指出，接种乙肝疫苗是预防乙肝的主要方法，建议婴儿出生后尽早(最好是在24h内)接种乙肝疫苗。重组酵母乙型肝炎疫苗是一种乙肝表面抗原(HbsAg)亚单位疫苗，采用转基因的方法将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建，转入酵母中，构建重组酵母，通过培养这种重组酵母来表达乙肝表面抗原亚单位。
[0005]2022年5月，第75届世界卫生大会通过的《2030年可持续发展议程》中确定了全球消除肝炎的目标，因此，生产一种产量高，成本低的重组乙型肝炎疫苗是完成这个目标的重要途径。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本公开提供了一种诱导乙肝表面抗原表达的方法、乙肝表面抗原纯化的方法、生产乙型肝炎疫苗的方法和乙型肝炎疫苗。
[0007]第一方面，本公开提供一种诱导乙型肝炎表面抗原表达的方法，所述方法包括：
[0008]将表达乙肝表面抗原的酵母，按照2.0～6.0％的比例接种到第一级培养基中进行一级发酵，得到第一级培养液；
[0009]取第一级培养液，按照2.0～6.0％的比例接种到第二级培养基中进行二级发酵，得到第二级培养液；
[0010]取第二级培养液，按照1.5～3.0％的比例接种到第三级培养基中进行三级发酵，当发酵液中细菌密度生长至OD
600
值为100～200，起始添加甲醇，诱导乙肝表面抗原表达，收获发酵产物。
[0011]在一些实施方案中，所述一级发酵的温度为33～35℃。
[0012]在一些实施方案中，所述二级发酵的温度为33～35℃，优选为33℃。
[0013]在一些实施方案中，所述三级发酵的温度为30～35℃，优选为33～35℃，更优选为33℃。
[0014]在一些实施方案中，所述OD
600
为130～170。
[0015]在一些实施方案中，甲醇(诱导物)的添加方式采取连续恒流添加的方式。
[0016]在一些实施方案中，在诱导培养过程，甲醇的添加量随发酵液OD
600
值以及发酵液量的增长同比例增长。
[0017]在一些实施方案中，在诱导培养过程中，甲醇的添加速度为1.0
‑
2.0mL/100OD
600
/L发酵液/小时(即若发酵液OD
600
为100，每小时每升发酵液中连续流加1.0
‑
2.0ml甲醇；若OD
600
为170，每小时每升发酵液中连续流加1.7
‑
3.4ml甲醇，即甲醇添加量随发酵液OD值以及发酵液量的增长同比例增长)。
[0018]在一些实施方案中，在诱导期间，控制所述第三级培养基的pH为4.0～6.0。
[0019]在一些实施方案中，酵母选自汉逊酵母、毕赤酵母和啤酒酵母。
[0020]在一些实施方案中，乙肝表面抗原的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示：
[0021]MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI。
[0022]在一些实施方案中，将HBsAg基因连接到pMD19
‑
T载体(宝生物工程有限公司)上，得到质粒pHBsAg，将质粒pHBsAg导入汉逊酵母，获得乙型肝炎汉逊酵母工程菌株。
[0023]第二方面，本公开提供一种乙肝表面抗原纯化的方法，所述方法包括：
[0024]1)将第一方面的发酵产物进行菌体破碎，离心后收集第一上清液；
[0025]2)在所述第一上清液中添加聚乙二醇，静置沉淀，离心，收集第二上清液；
[0026]3)在所述第二上清液中添加硅胶，以吸附所述第二上清液中的乙肝表面抗原，通过离心收集吸附有乙肝表面抗原的硅胶沉淀；
[0027]4)在所述吸附有乙肝表面抗原的硅胶沉淀中添加解吸附缓冲液，以解除硅胶对乙肝表面抗原的吸附，获得含乙肝表面抗原的第三上清液；
[0028]5)对所述第三上清液依次进行第一超滤、离子交换层析、第二超滤和凝胶过滤层析，得到乙肝表面抗原原液。
[0029]在一些实施方案中，在步骤2)中，先调节所述第一上清液的pH为5.0～8.0，再添加聚乙二醇；和/或
[0030]所述步骤2)中添加的聚乙二醇选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，优选为聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；和/或
[0031]在步骤2)中，聚乙二醇的终浓度为3％～6％，优选为4％～5％。
[0032]在一些实施方案中，在所述步骤3)中，硅胶以气相二氧化硅的形式添加，气相二氧化硅的终浓度为0.5％～2.0％。
[0033]在一些实施方案中，在所述步骤3)中，所述吸附的条件为2～8℃吸附12～20h。
[0034]在一些实施方案中，在所述步骤4)中，解除硅胶吸附的温度为50
‑
62℃，优选为52～62℃。
[0035]在一些实施方案中，所述解吸附缓冲液含有0.8
‑
3.4g/L的脱氧胆酸钠，优选为2
‑
3g/L。
[0036]在一些实施方案中，在所述步骤5)中，所述第一超滤采用截流孔径为50
‑
1000kDa
的超滤膜，进一步优选为300
‑
500kDa的超滤膜。
[0037]在一些实施方案中，在所述步骤5)中，所述离子交换层析为阴离子交换层析。
[0038]在一些实施方案中，所述离子交换层析使用的层析介质选自DEAE Sepharose Fast Flo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导乙型肝炎表面抗原表达的方法，其特征在于，所述方法包括：将表达乙肝表面抗原的酵母，按照2.0～6.0％的比例接种到第一级培养基中进行一级发酵，得到第一级培养液；取第一级培养液，按照2.0～6.0％的比例接种到第二级培养基中进行二级发酵，得到第二级培养液；取第二级培养液，按照1.5～3.0％的比例接种到第三级培养基中进行三级发酵，当发酵液中细菌密度生长至OD
600
值为100～200，起始添加甲醇，诱导乙肝表面抗原表达，收获发酵产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一级发酵的温度为33～35℃；和/或所述二级发酵的温度为33～35℃，优选为33℃；和/或所述三级发酵的温度为30～35℃，优选为33～35℃，更优选为33℃；优选地，所述OD
600
为130～170；优选地，在诱导期间，控制所述第三级培养基的pH为4.0～6.0。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，甲醇的添加方式采取连续恒流添加的方式；优选地，在诱导培养过程，甲醇的添加量随发酵液OD
600
值以及发酵液量的增长同比例增长；优选地，在诱导培养过程，甲醇的添加速度为1.0
‑
2.0mL/100OD
600
/L发酵液/小时。4.一种乙肝表面抗原纯化的方法，其特征在于，所述方法包括：1)将权利要求1至3中任一项所述的发酵产物进行菌体破碎，离心后收集第一上清液；2)在所述第一上清液中添加聚乙二醇，静置沉淀，离心，收集第二上清液；3)在所述第二上清液中添加硅胶，以吸附所述第二上清液中的乙肝表面抗原，通过离心收集吸附有乙肝表面抗原的硅胶沉淀；4)在所述吸附有乙肝表面抗原的硅胶沉淀中添加解吸附缓冲液，以解除硅胶对乙肝表面抗原的吸附，获得含乙肝表面抗原的第三上清液；5)对所述第三上清液依次进行第一超滤、离子交换层析、第二超滤和凝胶过滤层析，得到乙肝表面抗原原液。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，先调节所述第一上清液的pH为5.0～8.0，再添加聚乙二醇；和/或所述步骤2)中添加的聚乙二醇选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇10000，优选为聚乙二醇6000或聚乙二醇8000；和/或在步骤2)中，聚乙二醇的终浓度为3％～6％，优选为4％～5％。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，硅胶以气相二氧化硅的形式添加，气相二氧化硅的终浓度为0.5％～2.0％；和/或在所述步骤3)中，所述吸附的条件为2～8℃吸附12～20h。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤4)中，解除硅胶吸附的温度为50～62℃；和/或所述解吸附缓冲液含有0.8
‑
3.4g/L的脱氧胆酸钠，优选为2
‑
3g/L。8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤5)中，所述第一超滤采用截流
孔径为50
‑
1000kDa的超滤膜，进一步优选为300
‑
500kDa的超滤膜；优选地，在所述步骤5)中，所述离子交换层析为阴离子交换层析；优选地，所述离子交换层析使用的层析介质选自DEAE Sepharose Fast Flow、MoSphere
TM IEX
‑
50Q、MoSphere
TM IEX
‑
50DEAE、GP DEAE
‑
60或DEAE sephardex A

【专利技术属性】
技术研发人员：邹烨宁，赵冉，白迅，孟凡红，董高峰，张立志，薛晨宝，李研，胡雅灵，高强，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴中维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：