7-DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌及其构建与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种7

【技术实现步骤摘要】
7
‑
DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌及其构建与应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种7
‑
DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌株，及其构建方法和应用。
(二)
技术介绍

[0002]7‑
脱氢胆固醇(7
‑
dehydrocholesterol，7
‑
DHC)具有多种生物学功能，在紫外照射下，能直接转化成维生素D3，对维持骨骼的钙平衡、保护骨骼至关重要。另外，7
‑
DHC参与高脂血症的治疗，高浓度的7
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DHC的积累，有助于预防高血脂症。由于具有多种生物学活性，7
‑
DHC在食品、制药等行业都有着广泛的应用。但是7
‑
DHC的结构复杂，来源受限，主要通过羊毛脂提取和半化学合成获得，该路线资源消耗较大、提取及合成效率较低。
[0003]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种模式可食用菌具有麦角固醇的天然合成途径，合成涉及约30种酶，整个途径包括甲羟戊酸生物合成，焦磷酸法尼酯生物合成和麦角甾醇生物合成三个模块。且酿酒酵母生长周期短，发酵能力强，具有完备的遗传操作系统，是甾醇类化合物从头合成的理想底盘。目前主流的策略是利用代谢工程改造策略，通过敲除erg5/6基因，并异源表达C
‑
24还原酶DHCR24重构麦角固醇途径，实现7
‑
DHC的累积。目前，通过合成路径上7
‑
DHC的关键限制步骤的强化，结合基于模块化整合及细胞器理性改造策略提升胞内蓄积能力等策略，近年来，GUO等进一步筛选了DHCR24的来源，在增强这些基因表达的基础上敲除了内质网膜相关基因PAH1，发现这些都有利于固醇的合成。Lisha Qiu等人在工作中提到ΔGDH1，不仅能提高7
‑
DHC的滴度，还能增强菌株的生长速度。为了优化碳代谢流，他们使用CRISPRi技术降低ERG6的表达。Wenqian Wei等人关注角鲨烯后通路，注意到有一种ERG2表达的抑制剂，即MOT3。在去除对MOT3的抑制后，CTT1被整合到基因组中，保护细胞免受过氧化氢的伤害，最终改善了固醇的合成，显著提升了7
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DHC的合成能力，结合酵母的高密度培养工艺，实现了3g/L以上的发酵水平，已成为依赖传统提取工艺的重要替代路径，具有较好的市场应用前景。
[0004]随着酯类物质在细胞内转运存储机制探究的深入，多种内源性脂类运输蛋白被依次解析，可通过非囊泡转运的途径结合甾醇定向转运蛋白实现出胞分泌。胆固醇等甾醇在真核细胞中分布不均匀，这种现象在质膜(PM)中表现最为显著，质膜中含有60
‑
80％的细胞游离胆固醇，在PM中约含有35
‑
45％的脂质。这是细胞内稳态的一个关键方面，因为膜内固醇浓度的改变可能会极大地改变膜的物理性质(如流动性)，影响信号转导、膜运输或完整蛋白的功能等不同过程。越来越清楚的是，维持这种细胞内甾醇的分布依赖于一个严格控制的合成、运输和储存系统。病原体相关酵母(PRY)蛋白，作为一类甾醇结合蛋白，酿酒酵母中具有三个Pry家族成员，Roger Schneiter等人研究表明Pry1和Pry2参与甾醇转运分泌，而Pry3是一种与细胞壁结合的蛋白。此外，酿酒酵母含有另一种内源性甾醇转运机制，通过定位在晚期核内和溶酶体上的NPC2和NCR1。基于DHE的活细胞成像实验，发现NCR1和NPC2是将甾醇运送到液泡膜所必需的，尤其是当细胞处于饥饿状态时。此外，在众多的酯质交换蛋白中，还包括细胞质膜甾醇转运蛋白，如Aus1p与Pdr11p等，被广泛应用于疏水性酯类化合
物如胡萝卜素的出胞转运。此外，在酵母细胞中，锚定在细胞膜接触位点的脂交换家族蛋白Lam1p
‑
Lam6p具有酯交换结构域，其输水性口袋能够特异性识别多种甾醇化合物，在介导甾醇非囊泡依赖的物质转运过程中也起到重要的功能。近期，Sokolov等综述了麦角甾醇在酿酒酵母细胞中的合成及转运路径的转换过程，突出了Oshp与Lamp在促进甾醇非囊泡转运途径的重要功能。
[0005]作为亲脂性化合物，在有限的酵母细胞空间内，过量的7
‑
DHC容易造成胞内蓄积并导致产物抑制效应，成为限制单位细胞甾醇合成能力的重要因素。目前的研究都集中于提升细胞内产物的累积，并且该工艺提取过程需要通过细胞离心、破碎、有相萃取及副产物分离等过程，工艺较为复杂，工业化生产应用挑战大。转运工程被认为是最有前途的策略之一。针对已挖掘的多种酯类化合物的转运蛋白及其复杂的转运路径，如果能够构建有效的胞外分泌路径，实现7
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DHC的胞外分泌合成，不仅能够减轻产品毒性解除细胞内累积后代谢压力和有限合成空间局限，还能够简化下游分离纯化的难度，潜在降低分离成本，对推进以简单碳源的从头合成路线的工业化生产具有重要意义。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是通过代谢工程技术，提供可以将胞内从头合成的7
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DHC转运出胞的酿酒酵母基因工程菌株，及其构建方法和应用。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种7
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DHC出胞分泌合成的酿酒酵母菌株，由如下方法构建获得：将底盘菌酿酒酵母基因组强化表达截短3
‑
羟基
‑
3甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、角鲨烯环氧酶ERG1、NADH激酶POS5、羊毛甾醇去甲基化酶ERG11、角鲨烯合酶ERG9、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、磷酸戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸激酶ERG12、法尼基焦磷酸合酶ERG20、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19，并异源表达Gallus Gallus来源的24
‑
甾醇还原酶DHCR24，敲除麦角固醇合成所需的C
‑
22甾醇去饱和酶ERG5、半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80以及在GAL4系统中充当抑制因子的半胱氨酸蛋白酶GAL6和MIG1，敲除NADP
+
特异性谷氨酸脱氢酶GDH1，敲除二酰基甘油焦磷酸磷酸酶DPP1，敲除能将醇类脱氢的酶ADH3，并异源表达甾醇转运蛋白ST1和PR
‑
1，获得所述7
‑
DHC出胞分泌合成的酿酒酵母菌株。
[0009]优选的，所述底盘菌为酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C。
[0010]所述强化表达是指在酿酒酵母基因组上强化表达多拷贝数的tHMG1(可将3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1整合至多拷贝位点Ty1两端的重复δ序列)，以及在基因组上强化表达的1个拷贝数的ERG1、1个拷贝数的ERG11、1个拷贝数的POS5、1个拷贝数的ERG9、1个拷贝数的ERG8、1个拷贝数的ERG12、1个拷贝数的IDI1、1个拷贝数的ERG20、1个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种7
‑
DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌，由如下方法构建获得：将底盘菌酿酒酵母基因组强化表达截短3
‑
羟基
‑
3甲基戊二酰辅酶A还原酶tHMG1、角鲨烯环氧酶ERG1、NADH激酶POS5、羊毛甾醇去甲基化酶ERG11、角鲨烯合酶ERG9、异戊烯基焦磷酸异构酶IDI1、磷酸戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸激酶ERG12、法尼基焦磷酸合酶ERG20、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19，并异源表达Gallus Gallus来源的24
‑
甾醇还原酶DHCR24，敲除麦角固醇合成所需的C
‑
22甾醇去饱和酶ERG5、半乳糖/乳糖代谢调节蛋白GAL80以及在GAL4系统中充当抑制因子的半胱氨酸蛋白酶GAL6和MIG1，敲除NADP
+
特异性谷氨酸脱氢酶GDH1,敲除二酰基甘油焦磷酸磷酸酶DPP1，敲除能将醇类脱氢的酶ADH3，并异源表达甾醇转运蛋白ST1和PR
‑
1，获得所述7
‑
DHC出胞分泌合成的酿酒酵母基因工程菌。2.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于所述底盘菌为酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C。3.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于：通过P
GAP
启动子强化表达tHMG1，通过P
GAL2
启动子强化表达ERG1，通过P
GAL1
启动子强化表达ERG11，通过P
GAL1
启动子强化表达POS5，通过P
GAL1，10
双向启动子强化表达ERG8和ERG12，通过P
GAL1，10
双向启动子强化表达ERG20和ERG9，通过P
GAL1，10
双向启动子强化表达IDI1和ERG19，通过P
GAP
启动子异源表达DHCR24，通过P
GAL1
启动子异源表达ST1和PR
‑
1。4.构建权利要求1所述酿酒酵母基因工程菌的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)敲除麦角固醇合成所需的C
‑
22甾醇去饱和酶ERG5，并将P
GAP
‑
DHCR24
‑
T
CYC1
片段整合到酿酒酵母CEN.PK2
‑
1C基因组上的ERG5酶位点，构建得到的酿酒酵母命名为sc1菌株；(2)将P
GAL2
‑
ERG1
‑
T
CYC1
片段整合至sc1菌株基因组上，整合至GAL6位点，构建得到酿酒酵母命名为sc2菌株；(3)将P
GAL1
‑
tHMG
‑
T
CYC1
片段整合至sc2菌株基因组上Ty1两端的δ序列中，构建得到酿酒酵母菌株命名为sc3菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，柯霞，潘子豪，杜宏斐，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：