一种7-氨基头孢烷酸生产菌及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种7

【技术实现步骤摘要】
一种7
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氨基头孢烷酸生产菌及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及工程菌构建
，具体涉及一种7
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氨基头孢烷酸生产菌及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]7‑
氨基头孢烷酸(7
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Aminocephalosporanic acid，7
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ACA,结构式如图1所示)是合成头孢类抗生素的重要中间体。目前，7
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ACA由顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)的发酵产物头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC，结构式如图1所示)裂解而成。主要包括以下两种方法：传统工艺主要以化学法由CPC经羧基保护，酰胺键断裂与脱保护等多步工艺裂解生产7
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ACA。自1962年美国礼来公司成功地采用化学裂解法由CPC生产出7
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ACA以来，化学裂解法得到了深入的研究，已经实现工业化生产。具体操作工艺为：在酯化釜内投入头孢菌素C钠盐和反应溶剂二氯甲烷，再加入三乙胺及二甲苯胺后搅拌均匀，之后开始滴加三甲基氯硅烷，滴加完毕后继续在25
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30℃下搅拌1
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1.5h，把反应液加入氯化釜后冷却至
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40℃，再慢慢加入二甲苯胺并搅拌均匀后开始滴加五氯化磷，加完后冷却至
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30℃继续搅拌1.5
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2h然后去醚化工段。当料液和丁醇温度均低于
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55℃时开始滴加丁醇，加完后再将反应物冷却至
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30℃并保持该温度下继续搅拌1.5
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2h，然后将料液放到水解釜中，开始搅拌并加入甲醇和水，水解温度控制在
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10℃下5
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15min，水解结束后用浓氨水调节pH值至3.5，最后离心过滤，洗涤和干燥。由上述可知化学裂解法工艺复杂，需要大量有机溶剂，环境污染大。随着7
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ACA巨大市场需求的带动以及人们对环境保护的逐步重视，目前化学裂解法生产7
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ACA逐渐被环境友好的生物酶催化法所取代。
[0003]生物酶催化CPC生产7
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ACA自20世纪60年代晚期得到深入发展，主要包括两步酶法和一步酶法。两步酶法利用D
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氨基酸氧化酶(D
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amino acid oxidase，DAO)和戊二酰基
‑7‑
氨基头孢烷酸酰化酶(GL
‑7‑
ACA acylase，GAC)分步催化。首先CPC在DAO的催化作用下生成一个酮酸中间体(KA
‑7‑
ACA)，其十分不稳定，非常容易被上述反应中产生的H2O2氧化脱羧生成戊二酰基
‑7‑
氨基头孢烷酸(GL
‑7‑
ACA)；然后GL
‑7‑
ACA在GAC的催化作用下脱去侧链生成7
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ACA。通过对酶固定化的研究，两步酶法的工艺已经日趋成熟，但仍存在酶解路线长、氧化条件控制难度大、副产物多、产率低于化学裂解法等缺点；另一方面，近些年来随着蛋白质工程和生物信息学技术的发展，研究者对头孢菌素C酰化酶(CPC Acylase，CPC酰化酶)进行了工程菌表达及酶分子改造等方面的研究，从而使得一步酶法在工业生产中更加具有吸引力。
[0004]一步酶法是利用CPC酰化酶直接催化CPC合成7
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ACA，不必进行GL
‑7‑
ACA转换的中间过程，反应效率相当于化学法，转化率可达95％以上。一步酶法同时兼具化学法的优势(高效率和纯度)及两步酶法的优势(高经济性和环境友好)，因此成为目前7
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ACA合成工艺的研究热点。一步酶法技术已经在理论上得到了国内外广泛研究，特别是一步7
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ACA裂解酶的发酵、固定化技术已经得到了应用，但是仍然存在CPC酰化酶对底物CPC特异性不高、酶活力较低、酶提取不易和酶的固定化有待进一步改善等问题。
[0005]目前，无论是两步酶法还是一步酶法，都需要发酵获得CPC后再通过体外酶催化反应来生产7
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ACA。而Isogai等报道了将两步酶法中的DAO和GAC的基因克隆至顶头孢霉，结果在顶头孢霉体内表达的两个酶可以将顶头孢霉发酵获得的CPC直接在体内转化成7
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ACA，实现了直接发酵生产7
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ACA的目的。然而其发酵水平较低，7
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ACA的发酵产量只有150μg/mL，同时引入两个酶也带来众多副产物，因此未见后续报道。然而，由于顶头孢霉遗传操作困难，针对调控以及代谢方面的基础研究尚不充足，使得外源基因引入后难以使代谢流达到平衡，在发酵顶头孢霉产7
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ACA的研究中，均只有少量CPC转化为7
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ACA，制约了顶头孢霉作为工业菌株在发酵法合成7
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ACA中的应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的是提供一种合成7
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氨基头孢烷酸的方法。
[0007]本专利技术提供的方法，为在酵母菌中引入CPC酰化酶和头孢菌素C合成途径，得到重组菌，发酵所述重组菌，得到7
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氨基头孢烷酸；
[0008]所述CPC酰化酶，为如下A或B或C：
[0009]A)序列表中序列2所示；
[0010]B)序列表中序列1所示；
[0011]C)所述蛋白为将A或B所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有CPC酰化酶活性的由A或B衍生的蛋白。
[0012]上述方法中，所述酵母菌为酿酒酵母。
[0013]所述发酵所在体系中含有单糖。
[0014]所述单糖为半乳糖；
[0015]或，所述单糖为半乳糖和葡萄糖。
[0016]所述头孢菌素C合成途径所需要的酶包括异青霉素N合酶IPNS、异青霉素N差向异构酶IPNE、脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS、脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS、脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶、ACV三肽合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。
[0017]上述在酵母菌中引入CPC酰化酶和头孢菌素C合成途径为将所述CPC酰化酶的编码核酸和所述头孢菌素C合成途径的相关酶导入所述酵母菌中，得到所述重组菌。
[0018]具体为：
[0019]1)制备ACV合成菌株和表达CPC酰化酶和部分头孢菌素C合成途径的相关酶的质粒pACA1或质粒pACA2；
[0020]2)将所述质粒pACA1或所述质粒pACA2导入上述ACV合成菌株得到重组菌。
[0021]上述ACV合成菌株为将表达ACV三肽合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的质粒导入酿酒酵母BY4741中制备得到，具体为将重组质粒pESC
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Hyg
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成7
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氨基头孢烷酸的方法，为在酵母菌中引入CPC酰化酶和头孢菌素C合成途径，得到重组菌，发酵所述重组菌，得到7
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氨基头孢烷酸；所述CPC酰化酶，为如下A或B或C：A)序列表中序列2所示；B)序列表中序列1所示；C)所述蛋白为将A或B所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有CPC酰化酶活性的由A或B衍生的蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酵母菌为酿酒酵母。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵所在体系中含有单糖；所述头孢菌素C合成途径所需要的酶包括异青霉素N合酶IPNS、异青霉素N差向异构酶IPNE、脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS、脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS、脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶、ACV三肽合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。4.CPC酰化酶，为如下A或B或C：A)序列表中序列2所示；B)序列表中序列1所示；C)所述蛋白为将A或B所示蛋白的氨基酸序列末端添加标签序列且具有CPC酰化酶活性的由A或B衍生的蛋白。5.编码权利要求4所述CPC酰化酶的核酸分子。6.含有权利要求4所述CPC...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙周通，杨大猛，苏文成，曲戈，张武元，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：