一株高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株、构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一株高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主菌中敲除SEQ ID NO.1所示的YML115C基因所得，YML115C基因所编码的的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术所构建的酿酒酵母工程菌株在发酵12h后，神经酰胺达到8.90mg/gDCW，是野生型菌株的4.05倍。本发明专利技术所述工程菌株不但神经酰胺产量得到了提高，发酵条件较为简单，并且本发明专利技术酿酒酵母工程菌株的细胞壁较为脆弱易于后续的神经酰胺提取，降低投资成本，具有广阔的发展前景。具有广阔的发展前景。具有广阔的发展前景。

【技术实现步骤摘要】
ID NO.2所示。
[0010]进一步地，所述工程菌株是利用Cre/loxP重组系统，通过同源重组的方法，敲除SEQ ID NO.1所示的YML115C基因构建获得的；
[0011]其中，所采用的宿主菌为酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4741。
[0012]如上所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0013](1)根据SEQ ID NO.1所示的YML115C基因序列和Cre/loxP重组系统设计从酿酒酵母基因组敲除YML115C基因的引物及其序列，引物为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；
[0014](2)以Cre/loxP重组系统中携带有筛选标记的质粒为模版，使用步骤(1)中所设计引物，PCR扩增用于从酿酒酵母基因组敲除YML115C基因的DNA片段，并加以纯化；
[0015](3)将制备好的用于从酿酒酵母基因组敲除YML115C基因的DNA片段，采用高效酵母细胞转化法，转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741中；
[0016](4)通过筛选标记对应的营养缺陷型固体酵母培养基筛选得到重组酵母菌株。
[0017]进一步地，具体步骤如下：
[0018](1)根据SEQ ID NO.1所示的YML115C的核苷酸序列和Cre/loxP重组系统设计扩增引物：
[0019](2)以Cre/loxP重组系统质粒为模板，进行PCR扩增获得用于敲除YML115C基因的DNA片段；
[0020](3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后，切胶回收目的片段；
[0021](4)将目的片段采用醋酸锂转化法转入酿酒酵母BY4741；
[0022](5)通过组氨酸营养缺陷型固体培养基进行筛选，在组氨酸营养缺陷型固体培养基上生长出的单菌落为候选菌落；
[0023](6)对候选菌落的基因组中YML115C的点位进行基因测序，以确定YML115C被筛选标记基因替换成功，即得。
[0024]进一步地，每1L组氨酸营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base)6.5
‑
7g/L，灭菌结束后加入组氨酸缺陷型氨基酸混合物(
‑
Leu Do supplement powder)0.72
‑
0.84g/L和葡萄糖1.7
‑
2.3％，琼脂2
‑
3％，用ddH2O定容至1L；
[0025]其中，上述百分数均为质量浓度百分数。
[0026]如上所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株在神经酰胺生产方面中的应用。
[0027]利用如上所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株发酵生产神经酰胺的方法，步骤如下：
[0028]将高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株通过三区划线涂布于固体丰富培养基平板，25～30℃培养48
‑
72h，将活化后的菌种，接1
‑
2环于装有3
‑
5mL液体丰富培养基中，25～30℃，180
‑
220rpm条件下培养14
‑
20h即为种子培养液，将种子培养液按8
‑
15％接种量接入液体丰富培养基中，25～30℃，180
‑
220rpm条件下培养12
‑
24h，即得。
[0029]进一步地，每1L固体丰富培养基为：硫酸腺嘌呤0.055
‑
0.06g/L，酵母浸粉8
‑
12g/L，蛋白胨16
‑
24g/L，琼脂18
‑
22g/L，灭菌后加入葡萄糖1.8
‑
2.2％，用ddH2O定容至1L；
[0030]每1L液体丰富培养基为：硫酸腺嘌呤0.055
‑
0.06g/L，酵母浸粉8
‑
12g/L，蛋白胨16
‑
24g/L，灭菌后加入葡萄糖1.8
‑
2.2％，用ddH2O定容至1L；
[0031]其中，上述百分数均为质量浓度百分数。
[0032]一种如上所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株细胞内的神经酰胺含量测定的方法，具体步骤如下：
[0033](1)酿酒酵母工程菌株发酵结束后，收集全部菌体；
[0034](2)将收集到的菌体进行破碎；
[0035](3)使用有机溶剂萃取，合并溶剂层；
[0036](4)使用有机溶剂萃取多次，合并溶剂层；
[0037](5)氮气吹干有机溶剂层，并复溶提取物质；
[0038](6)使用UPLC/MS对所得到的物质进行检测；
[0039](7)计算细胞内神经酰胺含量。
[0040]一种如上所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株的生长曲线的测定方法，具体步骤如下：
[0041](1)将高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株和对照菌株分别接种于液体丰富培养基的试管中，25～30℃，200～220rpm/min的条件下培养12
‑
18h；
[0042](2)分别取30μL、40μL、50μL菌液依次加入含有1mL液体丰富培养基的EP管中，振荡混匀，取200μL加入100孔板中，并且取200μL液体丰富培养基作为对照；将100孔板放置于全自动生长曲线测定仪中，25～30℃培养，每隔1h测定波长600nm处的吸光度值；
[0043](3)以培养时间X为横坐标，OD
600
值Y为纵坐标，绘制生长曲线。
[0044]本专利技术取得的优点和有益效果：
[0045]1、本专利技术酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主菌中敲除SEQ ID NO.1所示的YML115C基因所得，本专利技术菌株通过Cre/loxP系统制备基因敲除工具盒，化转至酿酒酵母宿主菌中，获得高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株。本专利技术所构建的酿酒酵母工程菌株在发酵12h后，神经酰胺达到8.90mg/gDCW，是野生型菌株的4.05倍。本专利技术所述工程菌株不但神经酰胺产量得到了提高，发酵条件较为简单，并且本专利技术酿酒酵母工程菌株的细胞壁较为脆弱易于后续的神经酰胺提取，降低投资成本，具有广阔的发展前景。
[0046]2、本专利技术提供的酿酒酵母工程菌株不但具有产量高的优点，并且可以通过相对简单的方法条件进行发酵，在工业上易于实现并控制，投资成本低，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0047]图1为本专利技术中用于敲除YML115C基因的DNA片段扩增验证图；其中，M：DNA分子量标准；泳道1：经扩增后用于敲除YML115C基因的DNA片段；
[0048]图2为本专利技术中所构建酿酒酵母工程菌株中YML115C基因敲除PCR验证图；其中，M：DNA分子量标准；泳道1：YML115C基因敲除PCR验证；
[0049]图3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主菌中敲除SEQ ID NO.1所示的YML115C基因所得，YML115C基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是利用Cre/loxP重组系统，通过同源重组的方法，敲除SEQ ID NO.1所示的YML115C基因构建获得的；其中，所采用的宿主菌为酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4741。3.如权利要求1或2所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)根据SEQ ID NO.1所示的YML115C基因序列和Cre/loxP重组系统设计从酿酒酵母基因组敲除YML115C基因的引物及其序列，引物为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4；(2)以Cre/loxP重组系统中携带有筛选标记的质粒为模版，使用步骤(1)中所设计引物，PCR扩增用于从酿酒酵母基因组敲除YML115C基因的DNA片段，并加以纯化；(3)将制备好的用于从酿酒酵母基因组敲除YML115C基因的DNA片段，采用高效酵母细胞转化法，转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741中；(4)通过筛选标记对应的营养缺陷型固体酵母培养基筛选得到重组酵母菌株。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)根据SEQ ID NO.1所示的YML115C的核苷酸序列和Cre/loxP重组系统设计扩增引物：(2)以Cre/loxP重组系统质粒为模板，进行PCR扩增获得用于敲除YML115C基因的DNA片段；(3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后，切胶回收目的片段；(4)将目的片段采用醋酸锂转化法转入酿酒酵母BY4741；(5)通过组氨酸营养缺陷型固体培养基进行筛选，在组氨酸营养缺陷型固体培养基上生长出的单菌落为候选菌落；(6)对候选菌落的基因组中YML115C的点位进行基因测序，以确定YML115C被筛选标记基因替换成功，即得。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：每1L组氨酸营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础6.5
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7g/L，灭菌结束后加入组氨酸缺陷型氨基酸混合物0.72
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0.84g/L和葡萄糖1.7
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2.3％，琼脂2
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3％，用ddH2O定容至1L；其中，上述百分数均为质量浓度百分数。6.如权利要求1或2所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株在神经酰胺生产方面中的应用。7.利用如权利要求1或2所述的高产神经酰胺的酿酒酵母工程菌株发酵生产神经酰胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，屠琳娜，王德慧，张兴，夏梦雷，宋佳，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：