一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物领域、生物技术领域和畜牧与动物医学领域，提供了一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用。在本发明专利技术中，利用同源重组的方法，在巴氏毕赤酵母菌株X

【技术实现步骤摘要】
一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用


[0001]本专利技术属于微生物领域、生物
和畜牧与动物医学领域，具体涉及一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株及其应用。

技术介绍

[0002]铜（Cu）是一种资源丰富、成本低廉的过渡金属，是众多与生长发育等生物过程相关的酶的一部分，例如酪氨酸酶、对羟基苯基丙酮酸水解酶、多巴胺 β
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羟化酶等，对生物有机体而言是必不可少的。在动物饲喂过程中，铜可以改善动物的性能，能够降低腹泻的患病率，改善脂肪消化率。铜纳米颗粒（CuNPs）由于其相对较低的毒性和优异的广谱抗菌活性，是一种很有潜力的饲用替代抗生素。在过去几年中，化学方法是合成CuNPs的最佳方法，因为在还原步骤中需要较少的能量，形成尺寸和形状精度较高的均匀颗粒。然而，化学方法对环境有害，因为使用了各种危险化学品（肼或酒石酸氢钾），这些化学品具有致癌性、遗传毒性和细胞毒性。因此，急需开发一种环境友好的CuNPs合成方法。
[0003]利用微生物（包括细菌、放线菌、真菌和酵母等）进行的生物介导合成已发展成为传统纳米颗粒合成方法的一种有希望的替代方法。其中，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种用途较广、研究较为深入的金属还原模型，能够通过与呼吸过程相关的直接电子转移、沉淀细胞外或细胞内的金属纳米颗粒，已经成功应用于银纳米颗粒和硒纳米颗粒的生物合成。虽然P. pastoris已被用作模型生物进行金属铜的吸附研究，但是P. pastoris本身对铜的耐受性和吸附能力较低，在一定程度上限制了P. pastoris生物合成CuNPs的研究。因此提高P. pastoris的铜耐受和铜吸附含量是P. pastoris生物合成CuNPs研究的关键所在。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于构建一株耐铜的毕赤酵母菌株（Pichia pastoris），同时通过培养条件的优化，提高菌株对铜的富集含量。
[0005]为了克服现有技术不足，本专利技术提供了一株耐铜的巴斯德毕赤酵母菌株巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R。X
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Cyb5R菌株的出发菌株来源于野生型菌株巴氏毕赤酵母X
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33。巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R能够在30℃条件下，以YPD为培养基，在添加较高浓度硫酸铜下实现高生物量生长以此富集更多的铜，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。
[0006]本专利技术提供一种耐铜的巴氏毕赤酵母菌株X
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Cyb5R。其是由野生型巴氏毕赤酵母菌株X
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33通过用同源重组的方法过表达米曲霉来源的Cyb5R得到。优选地，所述细胞色素b
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5还原酶基因Cyb5R的基因号为AO090003000873。
[0007]同时提供，所述的毕赤酵母菌株在饲料抗生素领域中的应用。
[0008]本专利技术提供一种饲用替代抗生素的制备方法，其通过在培养基中添加硫酸铜好氧发酵所述的毕赤酵母菌株得到。
[0009]优选地，其中用YPD作为碳源和能量来源，通过添加硫酸铜发酵所述毕赤酵母菌
株。
[0010]进一步优选地，所述培养基中硫酸铜添加量浓度最高可达14 mmol/L，通常可以添加浓度为2
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12 mmol/L，所述毕赤酵母菌株铜富集量最高可达27 mg/g DCW。所用硫酸铜溶液均过滤后使用。
[0011]更具体地，所述培养基以YPD培养基作为基础培养基，其组分：20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母浸粉，使用之前在115℃ 下灭菌20 min。
[0012]在具体实施方式中，发酵的培养条件为30℃、220 rpm。
[0013]本专利技术还提供由上述制备方法得到的饲用替代抗生素。
[0014]本专利技术与现有技术相比的有益效果是：1.本专利技术提供的巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R对硫酸铜的耐受性可高达14 mmol/L。在12 mmol/L高浓度硫酸铜添加量条件下依旧保持较高生长速率，并且经过培养条件优化后铜富集含量可高达27 mg/g DCW。该菌株培养方法简单，后期生长迅速，适应性强，耐受性高。可作为饲粮抗生素替代物，具有良好的应用前景。
[0015]2.本专利技术提供的巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜条件下的生长均优于野生型巴氏毕赤酵母X
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33。在30℃、YPD+12 mmol/L的高浓度硫酸铜条件下，其早期生长速率较巴氏毕赤酵母X
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33提高97%。
[0016]3．在摇瓶培养条件下，本专利技术提供的巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜条件下对数中期的OD
600
均优于野生型巴氏毕赤酵母X
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33。在30℃、YPD+12 mmol/L的高浓度硫酸铜条件下，其OD
600
较巴氏毕赤酵母X
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33提高16.84%。
[0017]4. 在摇瓶培养条件下，本专利技术提供的巴氏毕赤酵母
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Cyb5R在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜条件下的生物量均优于野生型巴氏毕赤酵母X
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33。在30℃、YPD+12 mmol/L的高浓度硫酸铜条件下，其细胞干重较巴氏毕赤酵母X
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33提高10.53%。
[0018]5. 在摇瓶培养条件下，本专利技术提供的巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R在30℃、pH为3、YPD+12 mmol/L硫酸铜条件下铜富集的含量可高达27 mg/g DCW。
[0019]因此，本专利技术得到的饲用替代抗生素可作为饲粮抗生素替代物，具有绿色、环保、无污染、表达率高以及成本低等优势。
附图说明
[0020]图1为米曲霉中所有编码Cyb5R基因在金属硒存在下的基因表达热图。
[0021]图2为pPICZA
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Cyb5R质粒的构建图谱。
[0022]图3为AO090003000873基因改造菌株菌落PCR验证电泳图。
[0023]图4为改造菌株巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X
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33在30℃、YPD+不同浓度硫酸铜(2,4,6,8,10,12 mmol/L) 下的OD
600
。
[0024]图5为改造菌株巴氏毕赤酵母X
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Cyb5R与野生型巴氏毕赤酵母X
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33在30本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种耐铜且高富集铜的毕赤酵母菌株，其特征在于，其是通过同源重组的方法将米曲霉（Aspergillus oryzae）来源的细胞色素b
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5还原酶基因Cyb5R在野生型巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）X
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33菌株中的整合表达。2.如权利要求1所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述细胞色素b
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5还原酶基因Cyb5R的基因号为AO090003000873。3.如权利要求1或2所述的毕赤酵母菌株在制备铜纳米颗粒中的应用。4.如权利要求1或2所述的毕赤酵母菌株在制备饲用替代抗生素中的应用。5.一种饲用替代抗生素的制备方法，其特征在于，通过在基础培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴信，孟娇，刘书帆，高乐，鲍彤彤，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：