合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母菌株及其应用，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明专利技术首先获得了一株能够异源生产对香豆酸的解脂亚洛酵母重组菌株，通过游离质粒表达筛选不同的融合标签和连接肽长度融合表达Pc4CL1和VvSTS，以及利用不同启动子强度筛选出最优的白藜芦醇产量。最终，将最优的组合定点整合至基因组上以及增加一个融合基因拷贝数，在解脂亚洛酵母中实现了白藜芦醇的高效合成，使摇瓶产量达到201

【技术实现步骤摘要】
合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母菌株及其应用，属于基因工程及生物工程


技术介绍

[0002]白藜芦醇是天然存在于葡萄、浆果、虎杖和花生中的黄酮类多酚化合物。在植物中，白藜芦醇作为植物抗毒素抵御病原体入侵和感染。在自然界中，白藜芦醇有顺式和反式两种异构形式，但反式异构体是主要的生物活性形式。临床研究表明，白藜芦醇可以有效地改善糖尿病，心血管疾病和神经性系统疾病。此外，白藜芦醇也被作为食品和化妆品的原材料，有着广泛的商业应用价值。
[0003]白藜芦醇主要的获得方式是从植物中提取，但是植物提取的方法受季节性的影响较大，并且工艺复杂、生产成本高、产量低。虽然目前可以通过采用化学合成来增加白藜芦醇的产量，但生产过程复杂、需使用大量的有机溶剂以及产生许多副产物限制了其大规模生产。相比之下，采用微生物发酵法合成白藜芦醇具有更加绿色环保的优势。
[0004]白藜芦醇的合成需要L
‑
酪氨酸或L
‑
苯丙氨酸作为前体，通过结合3分子的丙二酰辅酶A生成白藜芦醇。通过在微生物宿主中表达植物途径的白藜芦醇合成途径，已经实现了白藜芦醇的从头合成，但是产量较低，对于工业化规模生产较为困难。解脂亚洛酵母作为一种典型的非常规产油酵母，有着完整的遗传操作工具，并且还含有大量的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A，是理想的白藜芦醇生产宿主。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母工程菌，以解脂亚洛酵母PO1f为出发菌株，在基因组上整合来源于Flavobacterium johnsoniae的酪氨酸解氨酶FjTAL，并表达来源于Petroselinum crispum的4
‑
香豆酸辅酶A连接酶Pc4CL1和来源于Vitis vinifera的二苯乙烯合成酶VvSTS。
[0006]在一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母Po1f公开于论文《Combining 26s rDNA and the Cre
‑
loxP System for Iterative Gene Integration and Efficient Marker Curation in Yarrowia lipolytica》。
[0007]在一种实施方式中，所述Pc4CL1和VvSTS通过质粒游离表达，或在基因组上整合表达。
[0008]在一种实施方式中，所述FjTAL由启动子TEFin启动并整合在D17位点。
[0009]在一种实施方式中，编码所述FjTAL的核苷酸序列如SEQ ID NO.l所示，所述启动子TEFin的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]在一种实施方式中，所述工程菌还在F1
‑
3位点整合表达了莽草酸途径基因YlARO1，解除了莽草酸反馈抑制的YlARO4
K221L
与YlARO7
G139S
基因，所述YlARO1、YlARO4
K221L
和YlARO7
G139S
的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示。
[0011]在一种实施方式中，编码所述Pc4CL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述VvSTS核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述基因Pc4CL1和VvSTS由启动子TEFin启动，并在重组菌株中游离质粒表达；所述启动子TEFin的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]在一种实施方式中，所述基因Pc4CL1和VvSTS融合表达。
[0013]在一种实施方式中，所述基因Pc4CL1和VvSTS通过连接肽GGGGS，(GGGGS)2，TPTP,(TPTP)2，EAAAK,(EAAAK)2，GSG,(GSG)2连接，获得融合基因。
[0014]在一种实施方式中，所述融合基因Pc4CL1
‑
EAAAK
‑
VvSTS编码的蛋白具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
[0015]在一种实施方式中，利用启动子TEFin、2xUASTEFin、4xUASTEFin、6xUASTEFin、8xUASTEFin、12xUASTEFin或16xUASTEFin启动所述融合基因，并在重组菌株中以游离质粒为载体表达。
[0016]在一种实施方式中，利用启动子12xUASTEFin启动所述融合基因，并整合在所述解脂亚洛酵母PO1f基因组的AXP位点和/或D2位点。
[0017]本专利技术还提供了所述解脂亚洛酵母工程菌在生产白藜芦醇中的应用。
[0018]在一种实施方式中，将培养至对数生长期的菌液接种至YPD培养基中，接种后OD达到0.6
‑
0.8，在28～30℃、200～220rpm下发酵不少于96h。
[0019]在一种实施方式中，用于种子培养的培养基为YPD培养基，含有：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH值自然。
[0020]本专利技术还要求保护所述重组菌，或白藜芦醇生产的方法，或利用解脂亚洛酵母合成白藜芦醇的方法在食品、医药、化工领域生产方面的应用。
[0021]有益效果：本专利技术以解脂亚洛酵母PO1f为宿主，通过表达Flavobacterium johnsoniae来源的酪氨酸解氨酶FjTAL，通过强化和改造莽草酸途径，获得能够高产对香豆酸的工程重组菌，然后表达来源于Petroselinum crispum的4
‑
香豆酸
‑
辅酶A连接酶Pc4CL1，来源于Vitis vinifera的二苯乙烯合成酶VvSTS，实现了白藜芦醇的从头合成，为白藜芦醇的合成提供了良好的基础。通过融合标签和启动子的筛选表达Pc4CL1与VvSTS提高酶催化效率，实现了解脂亚洛酵母中高效合成白藜芦醇，最终摇瓶产量达到201
±
3.3mg/L,对香豆酸含量为18.2
±
1.5mg/L。本专利技术将植物异源代谢途径整合到解脂亚洛酵母实现了白藜芦醇的高产，为后续的黄酮类或者多酚类化合物生物合成奠定了基础。
附图说明
[0022]图1为解脂亚洛酵母中异源合成白藜芦醇的代谢示意图。
[0023]图2为工程菌株在YPD培养下的对香豆酸和白藜芦醇色谱图(A)和质谱图(B)。
具体实施方式
[0024](一)培养基
[0025]LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。
[0026]YNB培养基：Yeast Nutrition Base 67.4g/L，葡萄糖20g/L，氨基酸(5g/L尿嘧啶，10g/L亮氨酸，根据需要适当缺失相应氨基酸)。
[0027]YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成白藜芦醇的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在，以解脂亚洛酵母PO1f为出发菌株，在基因组上D17位点整合来源于Flavobacterium johnsoniae的酪氨酸解氨酶FjTAL，并表达来源于Petroselinum crispum的4
‑
香豆酸辅酶A连接酶Pc4CL1和来源于Vitis vinifera的二苯乙烯合成酶VvSTS。2.根据权利要求1或2所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，在F1
‑
3位点整合表达了莽草酸途径基因YlARO1，解除了莽草酸反馈抑制的YlARO4
K221L
与YlARO7
G139S
基因。3.根据权利要求3所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，以pYlxp为表达载体，表达所述Pc4CL1和VvSTS基因。4.根据权利要求3所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，所述Pc4CL1和VvSTS在基因组上整合表达。5.根据权利要求4或5所述的解脂亚洛酵母工程菌，其特征在于，所述基因P...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，刘孟粟，陈坚，曾伟主，宁扬，余世琴，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：