一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用。本发明专利技术通过系统改造启动子、信号肽及共表达分子伴侣，成功实现了高水平胞外表达右旋糖酐酶，胞外酶活达到159.68U/mL，相较于未改造的出发菌株，酶活提高了2.1倍。进一步通过5L罐上放大发酵，酶活力达到了3257.23U/mL。达到了3257.23U/mL。达到了3257.23U/mL。

【技术实现步骤摘要】
一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]右旋糖苷(dextran)，又名α葡聚糖，是一类主要由α
‑
1，6糖苷键，夹杂着α
‑
1，3、α
‑
1，4糖苷键连接而成的葡聚糖大分子，由蔗糖经过肠膜状明串珠菌发酵而得来，其分子量大小随聚合度变化存在差异。
[0003]右旋糖酐酶可以专一性切割α
‑
1，6糖苷键，将大分子量葡聚糖水解为低分子量葡聚糖，异麦芽糖等，因此在制糖产业，龋齿防止和医用等领域有着广泛应用。在制糖工业中，右旋糖苷经过细菌从原料中的蔗糖发酵得来，因此右旋糖酐酶在制糖工业应用主要有：1)降低原料损耗；2)防止干扰物料衡算；3)降低因右旋糖苷的产生而引起的粘度增加的现象；4)提高蔗糖结晶质量。在龋齿防治方面，右旋糖酐酶可以降解因为牙床菌体繁殖产生的菌齿斑。在医药方面，低分子量右旋糖苷可以用作血容量补充药。
[0004]在自然界存在着众多能够产生右旋糖酐酶的菌株，包括各种原核以及真核生物。其真核来源有青霉以及绒毛小球菌以及斯氏油脂酵母等，近些年来也有报道在海洋微生物链卵菌属中也有发现。原核来源主要是链球菌，拟杆菌等。如今主要商品化右旋糖酐酶主要来源于毛壳菌属和青霉菌属。国内对右旋糖酐酶的菌株筛选主要来自于海洋菌群，主要有交替假单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)、链状菌(Catenovulumsp.DP03)、节杆菌(Arthrobacter sp.)、氧化节杆菌(Arthrobacter oxydans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)。其中大多数酶活力较低，只有来自于交替假单胞菌的右旋糖酐酶在经过优化后达到了270.1U/mL。
[0005]目前，商品化的右旋糖酐酶仍旧来自于野生菌，通过自然界筛选，进一步诱变提高酶产量，从而获得形状优良的高产菌株。但是利用野生菌生产右旋糖酐酶的同时，还会产生次级代谢产物，给分离带来一定困难，因此在应用上存在一定限制。近些年来，右旋糖酐酶的异源表达也被广泛研究。因此，构建右旋糖酐酶异源表达的工程菌，简化酶表达纯化工艺，优化成本，得到了越来越多的关注。国内外对右旋糖酐酶的异源表达研究已有20余年，主要的异源表达体系分为原核和真核。在原核表达体系中，主要宿主为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。2019年，王乐怡等以枯草芽孢杆菌为宿主，异源表达了来自细丽毛壳菌的右旋糖酐酶基因，最终酶活力为21.25U/mL。刘乐等在大肠杆菌中异源表达了来自海洋氧化节杆菌的经过改造的右旋糖酐酶基因，最终酶活力达到了50U/mL。原核表达体系相较于真核表达体系相对周期较短，但是对于真核来源的右旋糖酐酶基因，原核表达体系就存在着无法翻译后修饰的问题。除此之外，大肠体系因为难以实现分泌表达、获得目的蛋白需要对菌体进行破碎，操作繁琐，同时也存在产生内毒素的问题，因此，在真核表达体系中进行右旋糖酐酶的外源表达，受到了广泛关注。
[0006]毕赤酵母作为真核表达体系，被认为是GRAS菌株，有着优秀的外源蛋白分表达能
力，这使得其分泌的蛋白可以快速高效纯化。除此之外，以毕赤酵母作为表达宿主，可以对重组蛋白进行由内质网到高尔基体的翻译后修饰加工，这对于因此在近年来以毕赤酵母作为宿主进行重组蛋白表达发展迅速。Kang等所构建的斯达油氏酵母(Lipomyces starkeyi)来源的右旋糖酐酶重组毕赤酵母在10L发酵罐中酶活力达到了134U/mL。
[0007]总的来看，国内外对微生物右旋糖酐酶的研究已有一定成效，但是仍无法满足工业生产需求。如何构建高水平表达右旋糖酐酶的重组菌株，已经成为当下研究热点。

技术实现思路

[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株，本专利技术通过信号肽、启动子改造以及共表达分子伴侣来实现右旋糖酐酶的高效分泌表达，提供包含本专利技术基因的重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞。
[0009]本专利技术的第一个目的是提供一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株，所述毕赤酵母重组菌株是以毕赤酵母为宿主，以α(Δ57
‑
70)
‑
HL28为信号肽，采用启动子DAS2异源表达了右旋糖酐酶。
[0010]进一步地，所述右旋糖酐酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]进一步地，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]进一步地，所述启动子DAS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]进一步地，所述毕赤酵母重组菌还共表达了分子伴侣。
[0014]进一步地，所述分子伴侣为Kar2、Hac1、Ero1、Cne1、Ubc1、Hrd1、Sec1、Bmh2、Sly1、Vps33、Vps45、Sbh1、Sso2、Sec53或Ssa4。
[0015]进一步地，所述分子伴侣以质粒pGAPZA为载体。
[0016]进一步地，共表达分子伴侣Ssa4的重组质粒序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017]进一步地，所述毕赤酵母为毕赤酵母P.pastoris GS115。
[0018]进一步地，所述毕赤酵母重组菌株以质粒pPIC9K为表达载体。
[0019]本专利技术的第二个目的是提供一种采用所述毕赤酵母重组菌株在发酵生产右旋糖酐酶的方法，包括如下步骤：
[0020]将毕赤酵母重组菌株的种子液以5
‑
10％的接种量接种至发酵培养基中，培养12
‑
24h后，补料体积百分比为30％
‑
50％的甘油，至菌体湿重达到200
‑
250g/L，停止补料，使菌体饥饿1～3h，流加诱导剂诱导产酶。
[0021]进一步地，所述诱导剂为山梨醇与甲醇按照质量体积比为1:15～20配制得到。
[0022]进一步地，所述发酵培养基中含有60％
‑
85％ H3PO
4 26.7mL/L、CaSO4·
2H2O 0.5
‑
1.0g/L、K2SO
4 15
‑
20g/L、MgSO4·
2H2O 10
‑
20g/L、KOH 1
‑
10g/L、甘油20
‑
100g/L和PTM
1 1
‑
10mL/L。
[0023]进一步地，所述种子液是将毕赤酵母重组菌株接种至种子培养基中，于25～30℃、200～220rpm下培养至对数生长期，作为种子液。
[0024]进一步地，所述种子培养基含有：酵母粉10
‑
20g/L、蛋白胨20
‑
40g/L和葡萄糖10
‑
30g/L。
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达右旋糖酐酶的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌株是以毕赤酵母为宿主，以α(Δ57
‑
70)
‑
HL28为信号肽，采用启动子DAS2异源表达了右旋糖酐酶。2.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述右旋糖酐酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述启动子DAS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母重组菌还共表达了分子伴侣。6.根据权利要求5所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述分子伴侣为Kar2、Hac1、Ero1、Cne1、Ubc1、Hrd1、Sec1、Bmh2、Sly1、Vps33、Vps45、Sbh1、Sso2、Sec53或Ssa4。7.根据权利要求1所述的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母P.pastoris GS115。8.一种采用权利要求1～7任一项所述毕赤酵母重组菌株在...

【专利技术属性】
技术研发人员：史劲松，刘超，龚劲松，许正宏，苏畅，李恒，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：