一种毕赤酵母突变菌及其在蛋白质谷氨酰胺酶生产中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体提供了一种毕赤酵母突变菌及其在蛋白质谷氨酰胺酶生产中的应用。申请人通过基因工程手段和紫外诱变筛选获得一株蛋白质谷氨酰胺酶产量明显提高的突变菌，其保藏编号为CCTCC NO：M20211205。所述突变菌可以广泛应用于蛋白质谷氨酰胺酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。促进其广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母突变菌及其在蛋白质谷氨酰胺酶生产中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种毕赤酵母突变菌及其在蛋白质谷氨酰胺酶生产中的应用。

技术介绍

[0002]天然蛋白质含有较多的谷氨酰胺和天冬酰胺残基，以氢键的形式和其他氨基酸交联在一起，使得蛋白质溶解度降低，从而影响了乳化性，起泡性，凝胶性等，限制了蛋白质特别是植物蛋白在食品、饮料、保健品，医药等领域的应用。蛋白质脱酰胺可以解决这些问题，通过脱酰胺，蛋白质中的酰胺基转化为羧基，负电荷增加，降低蛋白质的等电点，同时也改变了蛋白质分子的空间结构，使得内部亲水基团暴露出来，2%
‑
6%的脱酰胺化就可以明显提高蛋白质的功能特性。
[0003]植物蛋白在食品领域有着极其广泛的使用，但是一直存在溶解度差，容易凝聚沉淀，乳化性，起泡性和稳定性差等问题，限制了植物蛋白的应用范围和功能性质，特别是功能性蛋白方面。针对植物蛋白存在的问题，可以采用脱酰胺法，水解蛋白侧链谷氨酰胺的酰胺基团，从而改善其溶解度，起泡性，乳化性等问题。
[0004]目前，谷氨酰胺转移酶、蛋白酶和肽谷氨酰胺酶都可以用于蛋白质脱酰胺，但是都存在自身的不足。谷氨酰胺转移酶过量使用会使蛋白质发生凝聚，蛋白酶的底物专一性较差，容易产生苦味，肽谷氨酰胺酶对高分子量的多肽和蛋白质不起作用，脱酰胺度低。而来源于解朊金黄杆菌的蛋白质谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.44），简称PG，是一种新型水解酶，对多种蛋白质，多肽或者短肽的酰胺基进行水解，不会导致蛋白质的交联和水解。从而提高蛋白质的溶解度和乳化性等，且该酶在弱酸性条件下稳定。美国食品药品管理局、加拿大卫生部、澳大利亚和新西兰食品标准局等允许将其作为食品工业用酶制剂使用。2020年我国也将其作为食品工业用酶制剂新品种列入了食品添加剂的目录中。
[0005]蛋白质谷氨酰胺酶的应用范围广泛，对米谷蛋白，玉米蛋白，大豆蛋白，酪蛋白，麦麸蛋白，脱脂牛奶，乳清蛋白，酸奶，椰子蛋白，燕麦蛋白等均具有脱酰胺效果。例如广泛应用于食品加工领域的面筋蛋白，经脱酰胺后，其溶解度和乳化性得到增强，同时降低了面筋蛋白抗原性，减少过敏反应。玉米醇溶蛋白在食品和医药辅料方面有优良性的性质， 蛋白质谷氨酰胺酶对玉米醇溶蛋白的改性，能改变其二级结构，分子间聚集力减弱，溶解度和乳化性质得到显著提升。
[0006]蛋白质谷氨酰胺酶的原产菌株解朊金黄杆菌，表达该蛋白的水平较低，国内外学者对其进行了一系列研究和选育，但仍不能达到工业生产的要求。近年来，开发的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等基因工程菌株，使得蛋白质谷氨酰胺酶的产量大幅提高，但是仍然不能达到工业生产水平。因此，目前开发蛋白质谷氨酰胺酶的高产菌株仍是本领域的研究重点。

技术实现思路

[0007]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种高产蛋白质谷氨酰胺酶的毕赤酵母突变
菌及其应用。申请人首先将来源于解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）的蛋白质谷氨酰胺酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）宿主细胞中实现了高效表达，然后进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株蛋白质谷氨酰胺酶表达量明显提高的突变菌，可广泛应用于该酶的生产。
[0008]本专利技术一方面提供了一种毕赤酵母工程菌株，所述菌株携带有表达蛋白质谷氨酰胺酶的重组质粒。
[0009]所述蛋白质谷氨酰胺酶的基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0010]本专利技术还提供了一种突变菌株毕赤酵母PG（Pichia pastoris PG），是以上述的毕赤酵母工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。
[0011]所述突变菌株已于2021年9月24日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211205。
[0012]本专利技术还提供了所述毕赤酵母突变菌株在生产蛋白质谷氨酰胺酶中的应用。
[0013]本专利技术首先构建得到重组表达蛋白质谷氨酰胺酶基因的工程菌毕赤酵母G，其摇瓶发酵上清液中蛋白质谷氨酰胺酶酶活力为4.2 U/ml，实现了蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的有效表达。
[0014]为了进一步提高蛋白质谷氨酰胺酶的产量，申请人以毕赤酵母G为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株毕赤酵母PG。该突变菌株摇瓶发酵上清液中蛋白质谷氨酰胺酶酶活高达6.0U/ml，比出发菌提高了42.9%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于蛋白质谷氨酰胺酶的生产，有利于显著降低该酶的生产成本，进而促进该酶的广泛应用。
具体实施方式
[0015]结合以下具体实施例，对本专利技术作进一步的详细说明。
[0016]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。例如，本专利技术可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌DH5a，毕赤酵母X
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33，载体pPICza，抗生素Amp和zeocin购自Invitrogen公司。
[0017]酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司。
[0018]本专利技术所用到的实验材料和试剂如下：培养基：大肠杆菌培养基LB（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0），LB
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Amp为LB 培养基加100ug/mL氨苄青霉素；大肠杆菌低盐培养基LLB（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，pH7.5），LB
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zeocin为LLB 培养基加50ug/mL氨苄青霉素；酵母培养基YPD（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）；酵母培养基BMGY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油（V/V））；酵母诱导培养基BMMY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇（V/V））。
[0019]试剂：三氯乙酸，Cbz
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Gln
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Gly，苯酚，亚硝酸铁氰化钠，KOH，K2CO3，次氯酸钠溶液，NaH2PO4，Na2HPO4。
[0020]但对于上述的试剂或材料，本领域的技术人员可以根据其所实现的功能在市场上出售的产品中进行选择，而不仅限于本说明书实施例的具体记载。
[0021]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有表达蛋白质谷氨酰胺酶的的重组质粒。2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述蛋白质谷氨酰胺酶的基因序列为SEQ ID NO:1，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。3.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的毕赤酵母突变菌是以权利要求2所述的毕赤酵母工...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宾，程斯达，康丽华，张静静，郭瑞，
申请(专利权)人：权利要求书一页说明书六页序列表三页，
类型：发明
国别省市：