一种生产二元酸的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生产二元酸的基因工程菌及其应用。通过在生产二元酸的菌株中下调GOGAT基因的表达、同时过量表达GDH基因获得所述基因工程菌。具体以现有维斯假丝酵母为出发菌株，采用基因组编辑的方法对铵氮吸收途径中的GS

【技术实现步骤摘要】
一种生产二元酸的基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种生产二元酸的基因工程菌、一种二元酸的制备方法、及所述基因工程菌在制备二元酸中的应用。

技术介绍

[0002]微生物培养过程中无机氮元素的吸收主要包括硝态氮和铵态氮，铵态氮元素作为无机氮源转换为有机氮的最终前体，其吸收主要通过两条途径实现：GDH(谷氨酸脱氢酶，EC:1.4.1.4)途径与GS
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GOGAT(谷氨酰胺合成酶
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谷氨酰胺：α
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酮戊二酸氨基转移酶,E.C.6.3.1.2
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E.C.1.4.1.13)途径。
[0003]如图1所示，两条途径吸收铵态氮都需要消耗还原力：GDH途径负责催化将铵态氮元素转移到α
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酮戊二酸生成谷氨酸，同时需要消耗NADPH，相应的GS
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GOGAT途径首先在GS的催化下，将一分子铵态氮转移至谷氨酸，生成谷氨酰胺，进而由GOGAT负责将铵态氮转移至α
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酮戊二酸，将其转化为谷氨酸。与GDH途径相比，GS
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GOGAT途径消耗NADH，但是每吸收一分子铵态氮，GS
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GOGAT途径需要多消耗一分子ATP。
[0004]在不同微生物中，GDH途径与GS
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GOGAT途径所起到的作用不尽相同。例如Macheda等在研究构巢曲霉(Aspergillus Nidulans)的氮吸收途径时发现，与野生型相比，缺失NADP依赖的GDH的突变子在铵态氮作为唯一氮源的培养基上生长缓慢，进一步敲除编码GOGAT基因，细胞完全无法在铵态氮作为唯一氮源的培养基上生长。缺失了GDH或GS
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GOGAT途径的粟酒裂殖酵母仍然能在铵氮培养基上生长，然而当两条途径均被阻断时，突变体的生长能力完全丧失(Perysinakis et al.,1995)。也有研究发现，在有些微生物中仅存在其中一条途径参与铵氮吸收：例如Agaricus bisporus中仅存在GS
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GOGAT途径，而在蓝细菌PC7120的异形胞中，尽管存在GS与GDH，但缺乏GOGAT，其依赖于从相邻的营养细胞中输入谷氨酸以维持GS的活性。Holmes的研究表明，GS
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GOGAT途径是Candida albicans,Candida tropicalis等假丝酵母铵氮吸收的主要途径(Holmes,1989，1991)。
[0005]谷氨酸脱氢酶GDH在已知绝大多数物种中起到连接碳元素与氮元素代谢的作用。依据所依赖的辅酶不同，分为NADH
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依赖的谷氨酸脱氢酶与NADPH
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依赖的谷氨酸脱氢酶两大类。在高等真菌中(deuteromycetes,ascomycetes and basidiomycetes)存在两种类型的GDH，而绝大多数低等真菌仅存在NADH依赖的谷氨酸脱氢酶。而前者编码115kDa大小的亚基，在真菌中通常以四聚体形式发挥功能，参与分解代谢；而NADPH依赖的谷氨酸脱氢酶则以六聚体形式存在，其编码的蛋白相对较小，约为50kDa，主要参与铵态氮的吸收。总之，谷氨酸位于氨基酸合成代谢途径中的核心，且涉及到氮元素的吸收利用，对细胞的生长代谢具有系统性的影响，但其对二元酸产生的影响研究较少。
[0006]近年来，微生物发酵法生产长链二元酸以其低碳、绿色、高效、副产物含量低等优势，已逐步替代传统的化学合成法，成为长链二元酸生产的主要方式。通过遗传修饰，改变铵氮吸收途径中GS
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GOGAT与GDH途径的表达水平，对于生物法合成二元酸过程中提高微生物氮源利用效率、增加二元酸的产量具有重要的意义。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种生产二元酸的基因工程菌及其应用，本专利技术采用基因组编辑的方法对产二元酸的菌株例如假丝酵母菌的铵氮吸收途径中的GS
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GOGAT和GDH途径进行遗传修饰，通过下调GOGAT阻断/弱化GS
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GOGAT途径，并过量表达GDH途径的方式，改造铵氮吸收途径，以此得到二元酸产量显著提高的生产长链二元酸的菌株。
[0008]本专利技术的第一方面提供一种生产二元酸的基因工程菌，其通过在生产二元酸的菌株中下调GOGAT基因的表达、同时过量表达GDH基因获得。
[0009]其中，所述下调GOGAT基因的表达的方式可为本领域常规，优选包括：
[0010]i)改变编码GOGAT基因的核苷酸序列；
[0011]ii)改变GOGAT基因的调控序列；
[0012]iii)i)和ii)同时使用；
[0013]iv)RNA干扰技术降低GOGAT基因的表达；
[0014]其中，所述过量表达GDH基因的方式可为本领域常规，优选包括：
[0015]i)增加编码GDH基因的拷贝数；例如向所述菌株的基因组中整合同源或异源的GDH基因或向所述菌株中转化携带有同源或异源GDH基因的表达载体；
[0016]ii)改变GDH基因的调控序列；例如优化所述调控序列的核酸序列，或者增加启动子和/或增强子的个数；
[0017]iii)i)和ii)同时使用。
[0018]在某一较佳实施方案中，所述下调GOGAT基因的表达的方式为缺失编码GOGAT基因的核苷酸序列；且，所述过量表达GDH基因的方式为过表达编码GDH基因的核苷酸序列。
[0019]本专利技术所述菌株较佳地选自棒状杆菌属、地霉属、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属或耶氏酵母属。
[0020]所述菌株更佳地为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清酒假丝酵母(Candida sake)。
[0021]本专利技术所述二元酸较佳地选自C9～C22长链二元酸中的一种或多种。
[0022]本专利技术所述二元酸更佳地C9～C18长链二元酸中的一种或多种。
[0023]本专利技术所述二元酸进一步较佳地为C10～C16长链二元酸中的一种或多种。
[0024]在某一较佳实施方案中，所述二元酸为癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸或十六碳二元酸。
[0025]本专利技术第二方面提供一种二元酸的制备方法，将本专利技术第一方面所述的基因工程菌发酵培养获得所述二元酸。
[0026]所述制备方法中，所述发酵培养的温度优选为25
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35℃例如30℃，pH优选为7
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9例如8。
[0027]所述发酵培养使用的培养基优选含有200～400mL/L烷烃，优选C9～C22长链烷烃中的一种或多种。
[0028]所述烷烃更优选为C10～C16长链二元酸中的一种或多种。
[0029]在某一较佳实施方案中，所述烷烃为癸烷、正十本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产二元酸的基因工程菌，其特征在于，其通过在生产二元酸的菌株中下调GOGAT基因的表达、同时过量表达GDH基因获得。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述下调GOGAT基因的表达的方式包括：i)改变编码GOGAT基因的核苷酸序列；ii)改变GOGAT基因的调控序列；iii)i)和ii)同时使用；iv)RNA干扰技术降低GOGAT基因的表达；和/或，所述过量表达GDH基因的方式包括：i)增加编码GDH基因的拷贝数；例如向所述菌株的基因组中整合同源或异源的GDH基因或向所述菌株中转化携带有同源或异源GDH基因的表达载体；ii)改变GDH基因的调控序列；例如优化所述调控序列的核酸序列，或者增加启动子和/或增强子的个数；iii)i)和ii)同时使用。3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述下调GOGAT基因的表达的方式为缺失编码GOGAT基因的核苷酸序列；且，所述过量表达GDH基因的方式为过表达编码GDH基因的核苷酸序列。4.如权利要求1
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3任一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述菌株选自棒状杆菌属、地霉属、假丝酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、酵母属或耶氏酵母属；优选地，所述菌株为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)或清...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘文波，董辰，张明明，刘修才，
申请(专利权)人：CIBT美国公司凯赛太原生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：