一种靶向白蛋白基因的sgRNA及低蛋白血症兔模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种靶向白蛋白基因的sgRNA及低蛋白血症兔模型的构建方法。本发明专利技术采用了一种单纯针对白蛋白基因的双sgRNA敲除的方式，来构建低蛋白血症兔模型。双sgRNA对家兔白蛋白基因进行敲除，增加了基因组大片段缺失的频率，较于单sgRNA敲除法敲除效率高，更易造成移码突变，只要其中有一条sgRNA发生修饰，都能够生成白蛋白基因敲除的兔模型，更有可能成功构建低蛋白血症兔模型，从而有利于对人低蛋白血症相关疾病的研究。究。究。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向白蛋白基因的sgRNA及低蛋白血症兔模型的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种靶向白蛋白基因的sgRNA及低蛋白血症兔模型的构建方法。

技术介绍

[0002]低蛋白血症是一种多种原因引起的临床综合征，重症感染患者常伴有低蛋白血症，其发生率为40％～50％。临床上认为患者血清总蛋白低于60g/L或者血清白蛋白低于35g/L时，即可诊断为低蛋白血症。而低蛋白血症血清白蛋白(albumin(ALB))浓度的降低，会对许多具有高蛋白结合率的药物的药代动力学产生影响，从而影响患者的治疗效果。
[0003]目前已有的低蛋白血症大、小鼠模型对于低蛋白血症患者的用药有一定的指导意义。但是大小鼠的体型与人类相差较大，并不能很好的模拟人类的相关疾病特征。兔子相比于小鼠有很多优势，生理、结构和遗传背景与人更相似，兔子具有相对较长的寿命，可以进行长期的体内评估。兔子有相对较大的尺寸，可以进行非致死性的采血，以及通过一些手术操作可以获得大量的细胞和组织样品。目前尚未有构建出低蛋白血症兔模型的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种靶向白蛋白基因的sgRNA及低蛋白血症兔模型的构建方法。本专利技术采用基因编辑(CRISPR/Cas9)技术并通过双sgRNA敲除白蛋白基因的的方式，获得低蛋白血症兔模型。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0006]第一目的，本专利技术提供了一种靶向敲除白蛋白基因的sgRNA，所述sgRNA为sgRNA1或sgRNA2；
[0007]sgRNA1：GCTCATCGGTTTAATGATGT；
[0008]sgRNA2：GCTCTTCATATGGGCACTTC。
[0009]本专利技术针对家兔白蛋白基因设计出两条sgRNA，sgRNA的靶位点碱基长度为20bp，使用两条sgRNA对家兔白蛋白基因进行敲除，增加了基因组大片段缺失的频率，较于单sgRNA敲除法敲除效率高，更易造成移码突变，只要其中有一条sgRNA发生修饰，都能够生成白蛋白基因敲除的兔模型，更有可能成功构建低蛋白血症兔模型，从而有利于对人低蛋白血症相关疾病的研究。
[0010]作为本专利技术所述靶向敲除白蛋白基因的sgRNA的优选实施方式，所述sgRNA1靶向白蛋白基因的第2外显子；所述sgRNA2靶向白蛋白基因的第3外显子。
[0011]本专利技术针对白蛋白基因第2外显子和第3外显子各设计出一条sgRNA，sgRNA的靶位点碱基长度为20bp，使用上述的两条sgRNA对家兔白蛋白基因进行敲除，增加了基因组大片段缺失的频率，敲除基因的效率较高，能够更好的构建低蛋白血症兔模型。本申请选用的靶点和构建的sgRNA可以高效的在靶点进行切割
[0012]第二目的，本专利技术提供了上述靶向敲除白蛋白基因的sgRNA在构建低蛋白血症兔模型中的应用。
[0013]第三目的，本专利技术提供了一种低蛋白血症兔模型的构建方法，包括以下步骤：
[0014]1)设计上述靶向敲除白蛋白基因的sgRNA，并利用体外转录技术获得所述sgRNA；
[0015]2)将步骤1)获得的sgRNA和Cas9 mRNA混合注射单细胞期兔受精卵，获得低蛋白血症兔模型。
[0016]本专利技术采用了一种单纯针对白蛋白基因的双sgRNA敲除的方式，来构建低蛋白血症兔模型。双sgRNA对家兔白蛋白基因进行敲除，增加了基因组大片段缺失的频率，较于单sgRNA敲除法敲除效率高，更易造成移码突变，只要其中有一条sgRNA发生修饰，都能够生成白蛋白基因敲除的兔模型，更有可能成功构建低蛋白血症兔模型。
[0017]作为本专利技术所述低蛋白血症兔模型的构建方法的优选实施方式，所述靶向敲除白蛋白基因的sgRNA与T7启动子相连。
[0018]作为本专利技术所述低蛋白血症兔模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤1)中，将rALB
‑
sgRNA
‑
F1/rALB
‑
sgRNA
‑
F2与T7
‑
83
‑
R互为模板进行PCR，PCR产物纯化制备sgRNA转录模板，并经过体外转录得到所述sgRNA。
[0019]作为本专利技术所述低蛋白血症兔模型的构建方法的优选实施方式，所述rALB
‑
sgRNA
‑
F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述rALB
‑
sgRNA
‑
F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0020]作为本专利技术所述低蛋白血症兔模型的构建方法的优选实施方式，所述T7
‑
83
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0021]作为本专利技术所述低蛋白血症兔模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤2)中，所述Cas9 mRNA的制备步骤为：通过PmeI单酶切线性化spCas9质粒，纯化得cas9 mRNA的DNA模板，所得cas9 mRNA的DNA模板经体外转录得cas9 mRNA。
[0022]作为本专利技术所述低蛋白血症兔模型的构建方法的优选实施方式，所述步骤2)中，所述sgRNA的终浓度为15ng/μL，所述Cas9 mRNA的终浓度为200ng/μL。
[0023]作为本专利技术所述低蛋白血症兔模型的构建方法的优选实施方式，所述构建方法还包括检测兔白蛋白基因靶点的引物，所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6～9所示。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0025]本专利技术使用兔模型模拟人低蛋白血症，兔子相比于小鼠有很多优势，生理、结构和遗传背景与人更相似，且具有相对较长的寿命，可以进行长期的体内评估。兔子有相对较大的尺寸，可以进行非致死性的采血，以及通过一些手术操作可以获得大量的细胞和组织样品。本专利技术采用了一种单纯针对白蛋白基因的双sgRNA敲除的方式，来构建低蛋白血症兔模型。双sgRNA对家兔白蛋白基因进行敲除，增加了基因组大片段缺失的频率，较于单sgRNA敲除法敲除效率高，更易造成移码突变，只要其中有一条sgRNA发生修饰，都能够生成白蛋白基因敲除的兔模型，更有可能成功构建低蛋白血症兔模型，从而有利于对人低蛋白血症相关疾病的研究。
附图说明
[0026]图1为兔白蛋白基因敲除示意图；
[0027]图2为体外转录的sgRNA1/sgRNA2电泳图；
[0028]图3为PCR检测兔白蛋白基因靶点引物设计示意图；
[0029]图4为sgRNA1位点PCR结果图；
[0030]图5为sgRNA2位点PCR结果图；
[0031]图6为F1R2大片段PCR结果图；
[0032]图7为sgRNA1位点sanger测序结果图；
[0033]图8为s gRNA2位点sanger测序结果图；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除白蛋白基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA为sgRNA1或sgRNA2；sgRNA1：GCTCATCGGTTTAATGATGT；sgRNA2：GCTCTTCATATGGGCACTTC。2.如权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA1靶向白蛋白基因的第2外显子；所述sgRNA2靶向白蛋白基因的第3外显子。3.如权利要求1或2所述的sgRNA在构建低蛋白血症兔模型中的应用。4.一种低蛋白血症兔模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)设计如权利要求1或2所述靶向敲除白蛋白基因的sgRNA，并利用体外转录技术获得所述sgRNA；2)将步骤1)获得的sgRNA和Cas9 mRNA混合注射单细胞期兔受精卵，获得低蛋白血症兔模型。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)中，将rALB
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sgRNA
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F1/rALB
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sgRNA
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F2与T7
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R互为模板进行PCR，PCR产物纯化制备sgRNA转录模板，并经过体...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐成程，李万胜，资崯，宁丽，鹿璇，郑伟，汪金玲，池玉娥，
申请(专利权)人：五邑大学，
类型：发明
国别省市：