一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析制造技术

本发明专利技术公开了一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析，属于银杏基因工程技术领域，本发明专利技术选择了lnc10和lnc11作为研究对象，从银杏叶片中成功克隆出lnc10和lnc11，并利用转基因和转录组测序等方法对其进行功能验证，从分子水平上揭示了银杏lnc10和lnc11对类黄酮生物合成具有正向调节作用，初步阐明了银杏lnc10和lnc11对类黄酮合成的调控机制，为lncRNA调控类黄酮的合成提供了理论依据。lncRNA调控类黄酮的合成提供了理论依据。lncRNA调控类黄酮的合成提供了理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析


[0001]本专利技术属于银杏基因工程
，具体涉及一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析。

技术介绍

[0002]银杏是银杏科银杏属唯一存活的孑遗植物，被认为是植物界的“活化石”。银杏具有极高的生态、经济、观赏和药用价值。黄酮类化合物是银杏中主要的次生代谢产物，广泛应用于食品、医药和天然保健品领域，在医学、科研等领域具有较高的研究价值，具有广阔的发展前景。长链非编码RNA(lncRNAs)通常是大于200nt、ORFs小于100aa且无明显蛋白编码能力的真核RNA，在植物体内的生命活动和发育过程中扮演着重要角色。尽管有关银杏类黄酮生物合成的研究较多，但大多数都集中在结构基因和转录因子调控类黄酮合成的分子机制上，而有关lncRNAs对银杏类黄酮合成生物学功能的研究报道很少。前期研究发现银杏中lnc10和lnc11等lncRNA可能参与类黄酮的合成，但是，其调控机制尚不清楚。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是针对现有的问题，提供一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离及功能分析。
[0004]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0005]一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，包括如下步骤：
[0006](1)根据银杏转录组数据库筛选出两个参与类黄酮合成的IncRNA，分别命名为Inc10和Inc11；
[0007](2)克隆Inc10和Inc11基因；
[0008](3)qRT
‑r/>PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量；
[0009](4)构建Inc10和Inc11过表达载体。
[0010]进一步地，步骤(2)中所述的Inc10和Inc11基因的克隆包括以下步骤：
[0011]1)分别采取新鲜的银杏根、茎、幼嫩叶、成熟叶、雄球花、雌球花、果实七个独立样本，将采集的材料迅速冻于液氮中，保存于
‑
80℃冰箱中备用；
[0012]2)参照RNA提取试剂盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit说明书进行RNA的提取；
[0013]3)参照RNA反转录试剂盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行RNA反转录；
[0014]4)以cDNA为模板，利用2
×
Rapid Taq Master Mix扩增lncRNA。
[0015]进一步地，步骤(3)中所述的qRT
‑
PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量具体为：以根、茎、叶、雄球花、雌球花和果实中7个组织的cDNA为模板，选取银杏GbNADPH作为内参基因，利用IDT在线网站设计特异性定量引物，进行实时定量PCR扩增。
[0016]进一步地，步骤(4)中所述的Inc10和Inc11过表达载体的构建，包括如下步骤：
[0017]1)对pBI121
‑
GUS选用Xba I和Xma I进行双酶切，37℃酶切1h，65℃水浴20min，使酶失活；
[0018]2)采用电泳检测上述酶切产物，并检测产物浓度。根据II One Step Cloning Kit说明书，按照载体与插入片段摩尔比为1:2的比例进行重组反应，37℃反应30min，将重组产物通过的热激法转入到DH5α并进行阳性验证和测序。
[0019]一种银杏类黄酮合成IncRNA的功能分析，包括如下步骤：
[0020](1)通过农杆菌介导转化拟南芥，获得转基因拟南芥植株；
[0021](2)HPLC检测转基因和对照组拟南芥中类黄酮含量；
[0022](3)拟南芥总RNA提取；
[0023](4)野生型和转基因拟南芥转录组文库构建及测序；
[0024](5)RNA
‑
seq分析，查找IncRNA和类黄酮代谢差异表达基因；
[0025](6)qRT
‑
PCR检测转基因和对照组拟南芥中差异表达基因，利用qRT
‑
PCR技术对转录组数据进行验证；
[0026](8)RNA Pull
‑
down
[0027]通过RNA pull
‑
down技术获得与lnc10互作蛋白，然后进行质谱分析。
[0028]本专利技术相比现有技术具有以下优点：
[0029]1、本专利技术利用qRT
‑
PCR技术检测了lnc10和lnc11在银杏根、茎、幼嫩叶、成熟叶、雄球花、雌球花以及果实中的表达水平。发现lnc10和lnc11在不同组织中均有表达，lnc10在叶片中的表达量最高，lnc11在雄花中的表达量最高。
[0030]2、本专利技术从银杏中克隆了lnc10和lnc11，构建了pBI121
‑
lnc10和pBI121
‑
lnc11的过表达重组质粒，并利用根癌农杆菌GV3101介导的植物遗传转化体系获得转基因拟南芥纯合子植株。
[0031]3、本专利技术通过对转基因拟南芥实验组和野生型对照组进行转录组测序，分别从WT vs lnc10和WT vs lnc11中筛选得到2019个和2552个差异表达基因。用GO分析和KEGG富集分析发现，类黄酮合成通路中存在显著富集的差异基因，与类黄酮生物合成相关的结构基因在lnc10
‑
OE和lnc11
‑
OE中均显著提高。对差异表达基因进行转录因子预测，发现大量MYB和bHLH转录因子。另外，转基因拟南芥中还发现大量差异表达的lncRNAs。利用qRT
‑
PCR技术对转录组数据进行验证，结果发现qRT
‑
PCR结果与RNA
‑
seq结果表达趋势一致，表明转录组数据准确可靠。
[0032]4、本专利技术初步解析了lnc10和lnc11对类黄酮的合成具有正向调节作用。与野生型拟南芥相比，lnc10和lnc11转基因植株中类黄酮化合物的含量均显著提高，表明lnc10和lnc11对拟南芥类黄酮的生物合成具有正向调控作用。
[0033]5、本专利技术筛选了与lnc10互作的蛋白。本专利技术通过RNA pull
‑
down技术，获得了与lnc10互作的蛋白，通过质谱结果分析发现，lnc10可能通过与Gb_04109表达的蛋白互作进而调控黄酮类化合物的合成。
[0034]6、本专利技术从分子水平上揭示了银杏lnc10和lnc11对类黄酮生物合成具有正向调节作用，初步阐明了银杏lnc10和lnc11对类黄酮合成的调控机制，为lncRNA调控类黄酮的合成提供了理论依据。
附图说明
[0035]图1为目的基因lnc10和lnc11的克隆、构建及农杆菌转化电泳图；
[0036]图2为lnc10和lnc11的二级结构预测图；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，其特征在于，包括如下步骤：(1)根据银杏转录组数据库筛选出两个参与类黄酮合成的IncRNA，分别命名为Inc10和Inc11；(2)克隆Inc10和Inc11基因；(3)qRT
‑
PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量；(4)构建Inc10和Inc11过表达载体。2.根据权利要求1所述的一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，其特征在于，步骤(2)中所述的Inc10和Inc11基因的克隆包括以下步骤：1)分别采集新鲜的银杏根、茎、幼嫩叶、成熟叶、雄球花、雌球花、果实七个独立样本，将采集的材料迅速冻于液氮中，保存于
‑
80℃冰箱中备用；2)参照RNA提取试剂盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit说明书进行RNA的提取；3)参照RNA反转录试剂盒HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行RNA反转录；4)以cDNA为模板，利用2
×
Rapid Taq Master Mix扩增lncRNA。3.根据权利要求1所述的一种银杏类黄酮合成IncRNA的分离，其特征在于，步骤(3)中所述的qRT
‑
PCR检测lnc10和lnc11在银杏不同组织中的表达量，具体为：以根、茎、叶、雄球花、雌球花和果实中7个组织的cDNA为模板，选取银杏GbNADP...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶家保，许锋，李宇婷，张威威，廖咏玲，王启剑，王莉娜，王采妮，詹雯琪，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：