提高人细胞中WAS蛋白表达的方法技术

本申请公开了一种提高人细胞中WAS蛋白(WASp)表达的方法，所述方法包括使用CRISPR/Cas9系统和同源重组核酸对人细胞中的突变WAS基因进行编辑。本申请所述的方法，在80

【技术实现步骤摘要】
提高人细胞中WAS蛋白表达的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求在2021年11月26日提交的申请号为202111422632.3的中国专利申请的优先权，其通过引用整体并入本文中。


[0003]本申请涉及基因编辑
，尤其涉及一种提高人细胞中WAS蛋白(WASp)表达的方法。

技术介绍

[0004]Wiskott
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Aldrich氏症候群(也称WAS综合征、湿疹血小板减少伴免疫缺陷综合症、Wiskott
‑
Aldrich syndrome,WAS)是一种X
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连锁的原发性免疫缺陷病，其致病原理是由于WAS基因突变导致Wiskott
‑
Aldrich蛋白(WASp)的表达或功能缺失。由于WASP蛋白在造血细胞中广泛表达，因而涉及其症状表现为血小板减少、湿疹、免疫缺陷，易患自身免疫性疾病和恶性肿瘤等。
[0005]WAS基因编码调节肌动蛋白细胞骨架的蛋白，引起多个造血细胞谱系中的改变的信号传导功能和/或发育。WAS是由WAS基因中的突变引起，产生WAS蛋白(WASp)的突变或缺失形式。
[0006]X连锁血小板减少症(XLT)是与WAS相关的遗传性凝血紊乱。XLT患者血小板的数目和大小改变从而影响凝血功能。XLT由WAS基因中的突变引起，导致WASp减少、缺失或改变。
[0007]造血干细胞(HSC)是一类可自我更新、可分化为各类血细胞和免疫细胞的干细胞，其被视为血液系统疾病，例如WAS和XLT的重要治疗细胞。而且自2009年首例利用造血干细胞移植(HSCT)治疗WAS病人以来，异源HSCT成为了根治WAS的标准疗法。但其最大的问题在于异源移植所带来的发病或致死的风险。为了减少免疫排斥的风险，通常需要HSC供者为病人HLA配型相同的兄弟姐妹或HLA匹配的非亲缘关系的供者，但通常很多病人无法及时的找到合适的供者，为治疗带来阻碍，加重了病情。因而，本领域开始探索，基于病人自体HSC进行基因编辑，将WAS突变基因修复，可从源头上解决治疗难题的基因治疗方案。
[0008]目前，基因治疗方案主要利用γ
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逆转录病毒、慢病毒或基因编辑系统作为载体。基于逆转录病毒或慢病毒载体的治疗虽然在一定程度上缓解了病人的症状，如减少出血、感染频率、改善湿疹。但WAS基因治疗的难点在于，WAS在几乎所有造血细胞中表达，因而需要经过治疗后在各个谱系细胞中恢复WAS表达，才能达到最好的治疗效果。目前，已公开报道的慢病毒基因疗法取得了一定的疗效，但由于病毒的使用可能会带来一些未知的副作用。而基于CRISPR基因编辑系统，相比基于逆转录病毒载体的基因疗法，可实现定点整合，对于安全性有更好的控制，因此是相对更优的选择。
[0009]此外，WAS的致病基因型和临床表型较复杂。据统计，致病位点可分布于WAS基因各外显子或内含子，包括错义突变、无义突变、缺失突变、移码突变等。因而，探寻一种能够安全有效高效地治疗各类致病基因型的WAS病人，寻找一种可以同时修复多个甚至全部治病
基因的工具，是我们亟待解决的问题。

技术实现思路

[0010]由于WAS病人的致病突变基因型非常多样、且在整个WAS基因大部分区域都有可能分布，因此，针对每种不同突变类型的病人设计特异性的修复疗法无异于杯水车薪，且某些突变受技术限制无法设计出合适的特异性修复工具。为了解决这个技术难题，本申请设计了将野生型WAS序列进行编码区优化的外源序列(coWAS)替代原突变WAS序列的解决方案，以修复WAS基因上可能存在的所有突变。
[0011]为了引入coWAS，最简单的方法是用逆转录病毒或慢病毒直接递送，但这种方式是将coWAS随机整合到患者基因组上，其可能带来的问题是：插入位点随机、基因表达水平不可控，且会产生潜在致癌风险；并且，这种方式只是引入coWAS，患者本身的突变型WAS基因仍然存在，突变型WAS蛋白仍会表达，因此，也可能会导致一些不可预知的安全性问题。为了解决这个技术难题，本申请提供了一种CRISPR/Cas9介导的定点同源重组(HDR)技术方案，实现coWAS在患者突变WAS基因原本表达位点的整合，使得coWAS获得与内源WAS基因类似的表达环境和表达水平，使突变WAS获得了较高的修复效率，基因修复后的HSC可以分化成具有正常功能的各类血细胞。
[0012]本申请具体技术方案如下：
[0013]1.用于哺乳动物细胞中突变WAS基因的修复系统，包括CRISPR/Cas9系统和同源重组核酸，其中所述CRISPR/Cas9系统包含：
[0014]1)靶向WAS基因的sgRNA、包含该sgRNA的复合物或编码该sgRNA的构建体；和
[0015]2)Cas9蛋白或表达该Cas9蛋白的核酸或构建体，
[0016]其中，所述同源重组核酸包含：
[0017]A.编码WAS蛋白(WASp)的核苷酸序列中至少部分核苷酸序列的外源WAS基因；
[0018]B.外源WAS基因5
’
和3
’
端的促进同源修复(HDR)的同源臂。
[0019]2.项1的WAS基因的修复系统，其中所述sgRNA包含选自SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:20
‑
SEQ ID NO:27中的任一序列。
[0020]3.项1或2的WAS基因的修复系统，其中所述外源WAS基因包含SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
[0021]4.项1
‑
3任一项的WAS基因的修复系统，其中所述外源WAS基因与其3
’
端同源臂之间还包含PolyA序列。
[0022]5.项4的WAS基因的修复系统，其中所述PolyA序列如SEQ ID NO:32所示，或与该序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性。
[0023]6.项4或5的WAS基因的修复系统，其中所述外源WAS基因与PolyA序列之间通过连接子连接。
[0024]7.项1
‑
6中任一项的WAS基因的修复系统，其中所述5
’
或3
’
端的同源臂的长度为200bp
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1200bp、200bp
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1000bp、300bp
‑
1000bp、300bp
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900bp、350bp
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850bp、400bp
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800bp、450bp
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750bp、500bp
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700bp或450bp
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700bp。
[0025]8.项1
‑
7任一项的WAS基因的修复系统，其中所述5
’
和3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于哺乳动物细胞中突变WAS基因的修复系统，包括CRISPR/Cas9系统和同源重组核酸，其中所述CRISPR/Cas9系统包含：1)靶向WAS基因的sgRNA、包含该sgRNA的复合物或编码该sgRNA的构建体；和2)Cas9蛋白或表达该Cas9蛋白的核酸或构建体，其中，所述同源重组核酸包含：A.编码WAS蛋白(WASp)的核苷酸序列中至少部分核苷酸序列的外源WAS基因；B.外源WAS基因5
’
和3
’
端的促进同源修复(HDR)的同源臂。2.权利要求1的WAS基因的修复系统，其中所述sgRNA包含选自SEQID NO:1
‑
SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:20
‑
SEQ ID NO:27中的任一序列。3.一种改善人细胞中WAS蛋白(WASp)表达的方法，包括使用CRISPR/Cas9系统和同源重组核酸对人细胞中的突变WAS基因组进行编辑，其中所述CRISPR/Cas9系统包含：1)靶向WAS基因的sgRNA、包含该sgRNA的复合物或编码该sgRNA的构建体；和2)Cas9蛋白或表达该Cas9蛋白的核酸或构建体，其中，所述同源重组核酸包含：A.编码WAS蛋白(WASp)的核苷酸序列中至少部分核苷酸序列的外源WAS基因；B.外源WAS基因5
’
和3
’
端的促进同源修复(HDR)的同源臂。4.权利要求3的方法，其中所述sgRNA包含选自SEQ ID NO:1
‑
SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:20
‑
SEQ ID NO:...

【专利技术属性】
技术研发人员：马奎莹，于玲玲，陆智伟，方日国，袁鹏飞，
申请(专利权)人：博雅缉因北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：