类器官高效编辑方法技术

本申请涉及一种优化的基因编辑类器官的方法，包括：将包装有Cas9蛋白编码序列及gRNA编码序列的慢病毒与类器官混合形成混合物；并将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养。通过所述方法可提高CRISPR系统编辑类器官的效率。同时本申请还涉及用所述优化的基因编辑类器官的方法编辑的类器官、利用所述方法构建的类器官高通量筛选文库、以及使用所述方法编辑的类器官或构建的类器官高通量筛选文库的用途。用途。

【技术实现步骤摘要】
类器官高效编辑方法


[0001]本申请涉及基因编辑技术，更具体的涉及运用慢病毒侵染的方法对类器官进行基因编辑的技术。

技术介绍

[0002]类器官是体外培养的三维结构的细胞培养物，主要来源于组织、胚胎干细胞或诱导多功能干细胞，由于它的自我更新及分化能力，可分化成多个类器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。对于类器官的研究，以前很多都是在PDX小鼠上建立模型，进行相关研究，这种方法费时且花费高，自从3D模型出现后，越来越多的人选择在3D模型进行疾病及治疗研究，可以节省时间成本。目前针对类器官编辑的方法有两种，一种是电转化，首先电转化时类器官数量受限制，只是小体积电转染，即进行电转染时，所述同时进行电转染的类器官总体积较小。这样并不能满足之后应用，如文库构建；其次对于较大的质粒，单次电转效率较低，而如果分两步电转，会造成类器官活率下降的问题；另一种是慢病毒侵染，这种方法不受类器官慢病毒转染类器官时同时转染的类器官的总细胞起始量的限制，但现有技术中慢病毒侵染类器官时，会出现侵染效率与编辑效率双低的问题；这些类器官来源基本上都是正常组织或肿瘤组织，很少有从PDX小鼠瘤分离原代肿瘤细胞来源类器官进行编辑，本申请在慢病毒侵染的基础上，通过对类器官培养基及侵染方法、侵染时间的改进，大大地增加了大质粒侵染及编辑效率，为了深入研究癌症发生机制以及药物新靶点的发现提供研究基础。

技术实现思路

[0003]为了解决现有技术中肿瘤原代肿瘤细胞来源的类器官不易培养、侵染效率及编辑效率较低等问题，本申请提供了一种基因编辑类器官的方法，其包括：用慢病毒转染将Cas9酶及gRNA同时导入类器官并进行表达。
[0004]1.一种基因编辑类器官的方法，其包括：
[0005]将包装有Cas9蛋白编码序列及gRNA编码序列的慢病毒与类器官混合形成混合物；
[0006]将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养。
[0007]2.根据项1所述的方法，其中所述类器官由人源肿瘤异种移植模型(PDX)动物瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成，
[0008]其中，在原代肿瘤细胞培养得到类器官的过程中使用基质胶。
[0009]3.根据项2所述的方法，其中将所述慢病毒与所述类器官混合前，所述类器官经温和的蛋白消化酶处理以与所述基质胶分离并分裂成均一大小的小型类器官，所述蛋白消化酶优选Tryple。在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为3至15分钟。在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为10分钟。
[0010]4.根据项1
‑
3中任一项所述的方法，其中在将所述慢病毒与所述类器官混合时，还在所述混合物中加入了助染试剂，优选所述助染试剂为TransDux Max转染试剂或与其有效
成分相同的转染试剂。
[0011]5.根据项1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述Cas9蛋白为spCas9蛋白。
[0012]6.根据项1
‑
5中任一项所述的方法，其中Cas9蛋白编码序列及gRNA编码序列通过同一慢病毒表达载体包装到慢病毒中。
[0013]7.根据项6中所述的方法，其中所述慢病毒表达载体还进一步包含筛选标记基因，优选所述筛选标记为荧光蛋白。
[0014]8.根据项6或7中的方法，其中所述慢病毒表达载体大于9KB，例如9.5KB，10KB，11～30KB、12～25KB、13～20KB、14KB等。
[0015]9.根据项1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述共同培养包括：
[0016]离心孵育步骤和基质胶培养步骤，
[0017]其中，所述离心孵育步骤是对所述混合物进行离心，所述离心孵育步骤中不加入基质胶；
[0018]所述基质胶培养步骤是将离心后的所述混合物中的类器官与基质胶混合并在培养基中培养。
[0019]10.根据项9所述的方法，所述离心的条件为100～800g，0.5～3h；优选地为500～800g，1～2h；最优选地为600g，1h。
[0020]11.根据项9或10所述的方法，其中所述共同培养还包括：
[0021]在离心孵育步骤和基质胶培养步骤之间的静置孵育步骤，
[0022]所述静置孵育步骤是将所述混合物静置孵育1～6h，例如3～6h，4.5～5h等；优选地为4h。
[0023]12.根据权利要求9
‑
11中任一项所述的方法，所述离心孵育步骤在常温下进行。
[0024]13.一种用慢病毒转染类器官的方法，其包括：
[0025]将慢病毒与类器官混合形成混合物；
[0026]将所述慢病毒与所述类器官的混合物共同培养。
[0027]在一些实施方案中，所述类器官为由人源肿瘤异种移植模型(PDX)动物瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成。
[0028]在一些实施方案中，所述类器官为经较大类器官经过蛋白酶消化处理形成的小型类器官。
[0029]在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为3至15分钟。在一些实施方案中，所述经温和的蛋白消化酶处理的时间为10分钟。
[0030]14.根据项13所述的方法，其中在将所述慢病毒与所述类器官混合时，还在所述混合物中加入了助染试剂，优选所述助染试剂为TransDux Max转染试剂或与其有效成分相同的转染试剂。
[0031]15.根据项13或14的方法，其中所述共同培养包括：
[0032]离心孵育步骤和基质胶培养步骤，
[0033]其中，所述离心孵育步骤是对所述混合物进行离心，所述离心孵育步骤中不加入基质胶；
[0034]所述基质胶培养步骤是将离心后的所述混合物中的类器官与基质胶混合并在培养基中培养。
[0035]16.根据项15中所述的方法，所述离心的条件为100～800g，0.5～3h；优选地为500～800g，1～2h；最优选地为600g，1h。
[0036]17.根据项15或16所述的方法，其中所述共同培养还包括：
[0037]在离心孵育步骤和基质胶培养步骤之间的静置孵育步骤，
[0038]所述静置孵育步骤是将所述混合物静置孵育1～6h；优选地为3～6h；最优选地为4h。
[0039]在一些实施方案中，所述离心孵育步骤在常温下进行。
[0040]18.一种使用如项1～12中任一项所述方法编辑的类器官。在一些实施方案中，所述类器官为经过如项1～12中任一项所述方法编辑7至10天后的类器官，例如经过如项1～12中任一项所述方法编辑8天或9天后的类器官，或者经过如项1～12中任一项所述方法编辑11、12、13、14、15、16、17、18、或19天的类器官。
[0041]19.一种由项18中所述的类器官组成的类器官基因文库。
[0042]20.一种将如项18中所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因编辑类器官的方法，其包括：将包装有Cas9蛋白编码序列及gRNA编码序列的慢病毒与类器官混合形成混合物；将所述慢病毒与类器官在所述混合物中共同培养。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述类器官由人源肿瘤异种移植模型(PDX)动物瘤分离的原代肿瘤细胞培养而成，其中，在原代肿瘤细胞培养得到类器官的过程中使用基质胶。3.根据权利要求2所述的方法，其中将所述慢病毒与所述类器官混合前，所述类器官经温和的蛋白消化酶处理以与所述基质胶分离并分裂成均一大小的小型类器官，所述蛋白消化酶优选Tryple。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中在将所述慢病毒与所述类器官混合时，还在所述混合物中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：金鸣，袁鹏飞，刘娜，申红艳，苏美华，李玉兰，郑雅茹，
申请(专利权)人：博雅缉因北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：