利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用技术

本发明专利技术提供一种利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用，属于基因工程和生物技术领域。本发明专利技术提供一种通过CRISPR/Cas9利用tRNA

【技术实现步骤摘要】
利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程和生物
，具体涉及里氏木霉基因组的改造，进一步涉及利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法及应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]里氏木霉具有分泌蛋白质的良好能力，可进行高效的蛋白质折叠与质量控制、系统的真核蛋白修饰以及有效的囊泡运输和分泌，从而有望成为工业化生产重组蛋白质的高效微生物细胞工厂。目前，里氏木霉已被应用于表达多种外源蛋白，如表达来自土曲霉的β
‑
葡萄糖苷酶、人的干扰素α
‑
2b以及南极念珠菌的脂肪酶B。里氏木霉在诱导条件下可产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，然而这会消耗能量并产生大量的背景蛋白，不利于异源蛋白质的表达和纯化。使用组成型启动子驱动表达异源蛋白，可在葡萄糖条件下发酵，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种sgRNA表达盒，其特征在于，所述sgRNA表达盒从5
’‑3’
具有以下结构：P
‑
R
‑
A
‑
S
‑
R
‑
B
‑
S
‑
R
‑
C
‑
S
‑
R
‑
D
‑
S
‑
R
‑
T，其中P为启动子、R为编码里氏木霉甘氨酸的tRNA序列、A、B、C、D为分别靶向不同基因的sgRNA中的20bp的原间隔序列、S为sgRNA序列骨架；T为T6终止子。2.如权利要求1所述的sgRNA表达盒，其特征在于，当靶向更多位点时，在所述T之前重复添加
‑
N
‑
S
‑
R
‑
序列即可，N为任意靶位点的原间隔序列；编码里氏木霉甘氨酸的tRNA序列具体如SEQ ID NO.1所示；所述启动子为5S rRNA，其序列具体如SEQ ID NO.2所示；所述sgRNA序列骨架为来自化脓性链球菌的sgRNA序列，进一步，所述sgRNA序列骨架其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.一种tRNA
‑
spacer系统，其特征在于，所述tRNA
‑
spacer系统包括连有两个或两个以上的相应的sgRNA的表达盒的Cas9基因的表达载体。4.如权利要求3所述tRNA
‑
spacer系统，其特征在于，所述表达载体含AMA1自主复制元件和抗性标记；所述tRNA
‑
spacer系统还包括一个或多个分别针对待编辑的基因的同源供体DNA序列。5.权利要求1
‑
2任一项所述sgRNA表达盒和/或权利要求3和4任一项所述tRNA
‑
spacer系统在基于CRISPR/Cas9基因编辑技术针对木霉进行基因编辑中的应用；所述基因编辑包括基因敲除以及供体DNA同源整合。6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述木霉为里氏木霉；具体的，所述应用包括：对里氏木霉的基因组进行多基因编辑，敲除纤维二糖水解酶1CBH1(P62694.1)、纤维二糖水解酶2基因CBH2(P07987.1)，并在cbh1的基因座位置引入过表达A.niger FGX55的葡萄糖氧化酶gox基因(EU532181.1)。7.一种利用tRNA多个串联sgRNA表达里氏木霉CRISPR/Cas9的建立方法，其特征在于，所述建立方法包括：S1、构建含ptrA抗性筛选标记和Cas9表达盒的质粒；S2、设计并合成包含两个靶向cbh1和cbh2的sgRNA表达盒；S3、构建靶向cbh1和cbh2定位敲除的CRISPR/Cas9载体；S4、构建表达葡萄糖氧化酶的供体DNA融合片段；S5、利用通过CRISPR/Cas9利用tRNA
‑
spacer系统对里氏...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟耀华，张佳欣，栗科航，刘红，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：