基于CRISPR特异性靶向猪Cavin-1基因的sgRNA及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR特异性靶向猪Cavin

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR特异性靶向猪Cavin
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1基因的sgRNA及应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种基于CRISPR特异性靶向猪Cavin
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1基因的sgRNA及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas9是一种存在于细菌和古生菌中的适应性免疫系统。利用人工合成的sgRNA序列与基因组DNA的碱基互补配对，Cas9核酸内切酶可以实现基因组的定点切割，从而产生DNA的双链断裂。DNA双链断裂可以通过两种方式进行修复：其一是采取非同源末端连接修复方式(NHEJ)，这种方式会在双链断裂处产生随机类型的插入/缺失修复，可能会造成基因的移码突变，造成基因功能缺失。另一种修复方式是在以单链寡核苷酸或者双链Donor质粒载体为模板的指导下，通过同源重组(HR)的方式实现预期的精准修复。
[0003]CRISPR/Cas9系统可以作为一种具有位点特异性的基因编辑系统，其最大的特点是操作简单、成本低、作用高效。CRISPR/Cas9系统凭借其巨大优势迅速成为基因编辑工具中的佼佼者，在基因功能研究、疾病模型、基因治疗等领域得到广泛的应用。
[0004]小窝(Caveolae)是一种大量存在于脂肪、肌肉与内皮等细胞表面的膜内陷结构，它由脂质(胆固醇、鞘糖脂和鞘磷脂)与蛋白质(小窝蛋白和脂质锚定蛋白)两部分构成，在细胞间信号传递、跨膜物质运输、脂质代谢、机械力响应等生理生化过程中发挥着重要功能。小窝相关蛋白1(Caveolae associated protein 1,Cavin
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1)在小窝的形成与功能实现过程中起着关键作用。人类Cavin
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1基因突变会引起4型先天性全身性营养不良(congenital generalized lipodystrophy type4,CGL4)，其病理特征是出生时或之后很快出现全身脂肪几乎完全缺失和肌肉极度发达。由于该基因在人、小鼠以及猪中具有保守性，因此，虽然目前相关研究集中在小鼠与人的层面，但该基因在大动物育种具有潜在利用价值。
[0005]现有的技术利用小鼠BAC克隆文库进行PCR，分别获取Cavin
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1基因一号外显子上下游4kb片段，并克隆进入pNT靶向载体的Neo原件的上下游，并将原核生物的LacZ原件克隆至Neo原件5
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端。随后，将这一线性化靶向载体电转至TC1 ES细胞中，用G418和FIAU筛选通过同源重组成功编辑的载体，并用PCR对ES细胞克隆点进行了评估。克隆点构建完成后，用EcorI或NdeI酶切基因组DNA，与跨越启动子区域的1.3kb XbaI
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XhoI探针杂交并筛选敲除成功的克隆点。最终将筛选的克隆点显微注射至C57BL/6小鼠囊胚中行成雌性嵌合体。将其与C57BL/6雄性小鼠交配行成Cavin
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1+/
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小鼠。
[0006]现有方法仅能制备Cavin
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1敲除小鼠，且经济成本高，操作难度大，时间长，无法在猪等大动物上进行复刻。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种高效靶向敲除猪Cavin
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1基因的sgRNA及其在Cavin
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1基因敲除猪上的应用。
[0008]本专利技术的技术方案为：基于CRISPR特异性靶向猪Cavin
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1基因的sgRNA，靶向猪Cavin
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1基因第1号外显子，sgRNA的靶序列为GTCAACGTGAAGACCGTGCG(SEQ ID No.1)。
[0009]一种基因敲除载体，含有上述所述的sgRNA序列。优选地，所述载体为pX458载体。
[0010]上述所述的sgRNA或基因敲除载体在猪Cavin
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1基因敲除上的应用。
[0011]一种Cavin
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1基因敲除猪模型的制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)利用CRISPR/Cas9系统选择Cavin
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1基因敲除靶点，设计sgRNA对应的寡核苷酸序列及其互补序列；所述寡核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，互补序列如SEQ ID No.3所示；
[0013](2)合成SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的寡核苷酸，退火形成双链DNA片段；
[0014](3)将步骤(2)得到的DNA片段与带有Cas9内切酶的表达载体连接，筛选阳性克隆，获得重组载体；
[0015](4)将步骤(3)得到的重组载体电转染猪成纤维细胞，筛选阳性克隆细胞，
[0016](5)将步骤(4)得到的阳性克隆细胞作为核供体细胞与去核卵母细胞融合得到重构胚胎，然后移植到发情母猪，全期发育获得Cavin
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1基因敲除的克隆猪。
[0017]进一步地，所述表达载体为pX458载体。
[0018]进一步地，所述猪成纤维细胞为巴马猪耳缘成纤维细胞。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0020]本专利技术设计的sgRNA能高效的敲除猪Cavin
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1基因，利用CRISPR/Cas9的基因编辑技术，低成本、高效率地获得了Cavin
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1敲除猪，为研究肌肉发育及肌肉相关疾病提供了动物模型。
附图说明
[0021]图1靶向猪Cavin
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1基因sgRNA位置示意图；
[0022]图2 pX458
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sgRNA重组质粒图谱；
[0023]图3 px458
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sgRNAs重组质粒序列测序峰图；
[0024]图4原代巴马猪成纤维细胞电转染后明场暗场观察
[0025]注：a：电转染后明场；b：电转染后暗场；
[0026]图5阳性单细胞克隆位点；
[0027]图6部分突变类型测序峰图；
[0028]图7野生型与双敲型的Cavin
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1蛋白活性预测结果；
[0029]图8新生Cavin
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1基因编辑仔猪。
具体实施方式
[0030]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
[0031]本专利技术所用试剂耗材见表1，酶切、连接、切胶回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
[0032]表1试验试剂耗材与厂商
[0033][0034][0035]1、猪Cavin
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1基因特异性sgRNA的设计和筛选
[0036]参照NCBI网站提供的猪Cavin
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1基因序列信息(Gene ID:106505427)，利用在线sgRNA设计网站Optimi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于CRISPR特异性靶向猪Cavin
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1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的靶序列如SEQ ID No.1所示。2.一种基因敲除载体，含有权利要求1所述的sgRNA序列。3.根据权利要求2所述的一种基因敲除载体，其特征在于，所述载体为pX458载体。4.权利要求1所述的sgRNA或权利要求2或3所述的基因敲除载体在猪Cavin
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1基因敲除上的应用。5.一种Cavin
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1基因敲除猪模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用CRISPR/Cas9系统选择Cavin
‑
1基因敲除靶点，设计sgRNA对应的寡核苷酸序列及其互补序列；所述寡核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙科任，李明洲，钟志宁，李晓开，张宇，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：