一种用于基因治疗的组成型启动子制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于基因治疗的组成型启动子。本发明专利技术提供的组成型启动子包括cyp4v2基因的核心启动子、RPE特异性元件、构成性转录因子、增强子和内含子。其启动活性显著增强，促进了cyp4v2基因的稳定表达，能够广泛应用到眼科的临床治疗中。能够广泛应用到眼科的临床治疗中。

【技术实现步骤摘要】
一种用于基因治疗的组成型启动子


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种用于基因治疗的组成型启动子。

技术介绍

[0002]CYP4V2基因属于细胞色素氧化酶P450家族V亚科，基因全长19.28kb，包含11个外显子，编码产物为525个氨基酸的蛋白质，主要发挥脂肪酸的ω
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氢基化作用，在生物体内主要催化多不饱和脂肪酸代谢，其内源性的底物是ω
‑
3族多不饱和脂肪酸。在眼部，CYP4V2是最主要的细胞色素酶，底物主要为二十二碳六烯酸(DHA)。
[0003]结晶样视网膜变性(BCD)是常染色体隐性遗传性疾病，主要是由于CYP4V2基因突变引起的一种相对罕见的视网膜变性，在1937年由Bietti首次报道。典型的症状为黄白色闪光结晶样物质沉积于视网膜，伴有视网膜色素上皮萎缩、变性和脉络膜毛细血管硬化。BCD患者在世界范围内比较罕见，发病率大约为1/67000，在亚洲的病例相对较多，发病率大约为1/24000。研究表明，CYP4V2蛋白在人的视网膜和ARPE
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19细胞的内质网中呈高表达，在角膜上皮也可检测到其表达。
[0004]基因疗法是一种通过将治疗性遗传物质转移到靶细胞来治疗某些疾病的方法。近年来，基因治疗研究发展迅速，在多种罕见病中表现优异，是一种理想的治疗方法。基因治疗的三个要素包括靶细胞、核酸和转移方法。因此，在基因治疗过程中，选择合适的载体，可控有效的表达，是成功的关键之一。目前已确定CYP4V2基因为BCD的致病基因，可用基因诊断的方法对患者及携带者进行筛查，但尚无有效的治疗方法，因此利用基因疗法建立针对BCD的治疗体系对于结晶样视网膜变性的临床研究和诊断具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种用于基因治疗的组成型启动子。本专利技术提供了经过两轮优化后的CYP4V2基因的核心启动子，以及该组成型启动子在治疗结晶样视网膜变性疾病中的应用。
[0006]本专利技术提供了一种组成型启动子，其包括启动子、特异性元件和/或转录因子；
[0007]所述启动子为cyp4v2基因上游的启动子，其核酸序列如SEQ ID NO：1～6中的任一项所示；
[0008]所述特异性元件为RPE特异性元件，其特异性靶向视网膜色素上皮蛋白；
[0009]所述转录因子为构成性转录因子。
[0010]其中，所述启动子的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；
[0011]所述RPE特异性元件的核酸序列如SEQ ID NO：7所示；
[0012]所述构成性转录因子的核酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0013]本专利技术提供的所述组成型启动子，包含cyp4v2基因上游约600bp的核心启动子，其核酸序列如SEQ ID NO：2所示，其表达活性比SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3～6所示的cyp4v2基因上游的300bp启动子、900bp启动子、1200bp启动子、1500bp启动子或2000bp启动子的表
达活性都要高。所述启动子表达活性通过双荧光系统试验来检测，不同的组成型启动子中分别增加有荧光素酶。所述RPE特异性元件为视网膜色素上皮启动子，特异性靶向视网膜色素上皮相关蛋白，所述构成性转录因子能够与cyp4v2基因5
’
端上游特定序列专一性结合，保证了cyp4v2基因的稳定转录，进一步增强了所述组成型启动子的表达活性。
[0014]进一步的，本专利技术所述的组成型启动子还包括增强子；所述增强子为CMV enhancer，是巨噬细胞病毒增强子，能够进一步增强细胞中重组蛋白的高效表达，其具有如SEQ ID NO：9所示的核酸序列。
[0015]更进一步的，所述组成型启动子还包括内含子；所述内含子选自CBAintron、Shorten CBA intron、Hybrid intron和/或EF1αintron。
[0016]具体的，在本专利技术的实施例中，通过对所述cyp4v2基因上游约600bp的核心启动子增加增强子和不同的内含子来筛选表达活性最高的组成型启动子，通过在不同组合的启动子中分别增加荧光素酶来检测启动子的表达活性。结果表明，增加CMV enhancer和CBA intron、Shorten CBA intron、Hybrid intron或EF1αintron中的任意一种启动子后的组成型启动子比没有增强子或者含有其他内含子的表达活性更好。更具体的，cyp4v2基因上游约600bp的核心启动子增加有RPE特异性元件、构成性转录因子sp1、CMV enhancer和CBA intron的组成型启动子表达活性最高。
[0017]本专利技术提供了所述的组成型启动子在转录cyp4v2基因中的应用。
[0018]本专利技术提供了包括本专利技术所述的组成型启动子的包装载体。
[0019]本专利技术所述的包装载体，能够将核酸或者蛋白包被起来，传递至培养的细胞或者人体内，具有递送遗传物质的功能，其可以是病毒载体也可以是质粒载体，其中病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和逆转录病毒；质粒载体包括原核载体和真核载体。在本专利技术的实施例中，选择腺相关病毒载体转染本专利技术的组成型启动子。
[0020]具体的，本专利技术所述的腺相关病毒载体中的腺相关病毒为单链线状DNA缺陷型病毒，无包膜，在腺病毒或者单纯疱疹病毒的辅助下能感染多种细胞。腺相关病毒载体则是不需要腺病毒辅助的包装系统，其在宿主体内的感染效率极高。
[0021]所述腺相关病毒载体包括但不限于AAV2、AAV8和/或AAVGL。
[0022]本专利技术提供了表达质粒，其包括cyp4v2基因、表达载体和所述的包装载体。
[0023]本专利技术所述的表达载体，是能够让目的基因在宿主细胞内稳定表达的载体，包括克隆载体的基本骨架、目的基因和表达元件。常用细菌质粒进行表达载体的构建，在本专利技术的实施例中，采用大肠杆菌质粒来进行表达载体的构建。
[0024]本专利技术提供了宿主细胞，其包括所述的包装载体或表达质粒。
[0025]本专利技术所述的宿主细胞，能够在体内稳定表达外源DNA，其包括动物细胞、植物细胞、微生物细胞、细菌和酵母。在本专利技术的实施例中，采用动物细胞293T和ARPE19作为宿主细胞，来进行cyp4v2基因的表达。
[0026]本专利技术还提供了所述包装载体、表达质粒或宿主细胞在制备治疗和/或预防结晶样视网膜变性的产品中的应用。
[0027]具体的，在本专利技术的实施例中，将含有本专利技术所述启动子的cyp4v2基因用AAV外壳包装后注射到小鼠眼球中，检测cyp4v2蛋白的表达情况。结果表明，含有本专利技术提供的组成型启动子的cyp4v2蛋白在小鼠眼睛中均有表达，且都比含有已知EF1α启动子的cyp4v2蛋白
表达量高。
[0028]本专利技术还提供了治疗和/或预防结晶样视网膜变性的药物，包括本专利技术所述的包装载体、表达质粒或宿主细胞的产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.组成型启动子，其特征在于，包括启动子、特异性元件和/或转录因子；所述启动子的核酸序列如SEQ ID NO：1～6中的任一项所示；所述特异性元件为RPE特异性元件，其特异性靶向视网膜色素上皮蛋白；所述转录因子为构成性转录因子。2.根据权利要求1所述的组成型启动子，其特征在于，所述启动子的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述RPE特异性元件的核酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述构成性转录因子的核酸序列如SEQ ID NO：8所示。3.根据权利要求1或2所述的组成型启动子，其特征在于，还包括增强子；所述增强子为CMV enhancer，其具有如SEQ ID NO：9所示的核酸序列。4.根据权利要求1～3任一项所述的组成型启动子，其特征在于，还包括内含子；所述内含子选自CBA intron、Shorten C...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈书元，蓝星，贺晨涛，叶国杰，吴振华，王立军，
申请(专利权)人：杭州嘉因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：