一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用。本发明专利技术利用新兴的单碱基编辑技术，将SURE基因组中的Kanamycin抗性进行有效敲除，构建无Kanamycin抗性的SURE菌株用于后续的感受态制备以及AAV相关质粒构建，降低了ITR丢失频率，解决了目前AAV载体和SURE菌株由于具备相同Kan抗性标签而无法使用的问题。Kan抗性标签而无法使用的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体的说是涉及一种敲除Kan抗性基因的 SURE菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]作为基因治疗新兴的明星载体，腺相关病毒(AAV)载体备受关注，其基因组两端的两个反向末端重复序列(ITR)是AAV包装复制必须的结构，但是ITR非常容易丢失从而影响病毒颗粒的包装和感染力。研究表明，ITR序列的不同区段缺失，都会对rAAV的生产造成影响。特别是在产业化生产过程中，大规模发酵时产生的ITR序列的部分或完全缺失，将造成AAV产量的严重下降。AAV载体质粒构建过程中，提高ITR稳定性愈发重要。
[0003]SURE菌种是K
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12系大肠杆菌，菌株体内重组酶系统整条通路被破坏，从而利用SURE菌株制备的感受态细胞在克隆实验中提高了外源甲基化DNA 的克隆效率，增强外源DNA的稳定性；解决真核生物DNA存在较多“十字型”、“Z字型”等二级或三级结构导致的克隆问题，可进行蓝白斑筛选。此菌种可以抑制无用处的DNA重排，故专门用来克隆那些在常规菌种不稳定的DNA片段，如重复DNA片段、Z
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DNA、超长质粒和其他不稳定片段，针对AAV相关质粒构建，防止ITR丢失有非常好的效果。
[0004]SURE菌株自身携带Kanamycin抗性，同时临床使用的AAV质粒同样需要使用Kanamycin抗性，导致临床使用的质粒无法利用SURE感受态进行构建、扩繁，而目前尚未有有效的构建方法来构建能够有效敲除Kan抗性基因的SURE菌株，从而限制了AAV载体质粒产业化应用。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株及其构建方法，是的所述构建方法能够有效敲除SURE菌株Kan抗性基因，用于后续的感受态制备以及AAV相关质粒构建，降低ITR丢失频率；
[0006]本专利技术的另外一个目的在于提供上述菌株及其构建方法在AAV质粒构建或疫苗制备中的应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株，由单碱基编辑系统敲除SURE基因组中的Kanamycin抗性基因。
[0009]单碱基基因编辑技术，又称不依赖于DNA链断裂的基因编辑技术； dCas9
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PmCDA1
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UGI和Cas9n
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PmCDA1
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UGI单碱基编辑系统是基于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶PmCDA1开发的两种单碱基编辑系统，PmCDA1能催化C脱氨基变成U，而U在DNA复制过程中会被识别成T，尿嘧啶糖基化酶抑制剂 UGI能防止尿嘧啶糖基化酶将U糖基化引起碱基切除修复。利用sgRNA将 Cas9
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胞嘧啶脱氨酶
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尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成的融合蛋白靶向于 gRNA(sgRNA中与目标DNA互补配对的序列)互补配对的靶位点，并将该靶位点的胞嘧啶(C)的氨基去除，从而
使得C变成尿嘧啶(U)，随着DNA的复制， U又会被胸腺嘧啶(T)替代，最终实现单碱基C
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T的精确、高效突变。
[0010]在本专利技术具体实施方式中，所述单碱基编辑器系统为基于 dCas9
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PmCDA1
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UGI的单基因编辑器系统，可通过将各基因原件可被承载在市售载体上使用；dCas9、PmCDA1、UGI序列来自Addgene质粒 pScI_dCas9
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CDA
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UL，质粒编号：108551。
[0011]在本专利技术具体实施方式中，所述单碱基编辑器系统的gRNA序列为SEQID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列：CGAGCGAGCACGUACUCGGA 和/或GAACAAGAUGGAUUGCACGC。
[0012]所述gRNA所针对的Kanamycin抗性基因靶点分别为其序列的259
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278bp 靶点(GAACAAGATGGATTGCACGC)和675
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694bp靶点 (CGAGCGAGCACGTACTCGGA)，Kanamycin抗性基因如SEQ ID NO.3所示。所述gRNA同样可以通过载体转录出来，更为高效的是可以同 dCas9
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PmCDA1
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UGI构建到相同的载体上，在载体上的转录gRNA的序列如SEQ ID NO.4(CGAGCGAGCACGTACTCGGA)和SEQ ID NO.5 (GAACAAGATGGATTGCACGC)所示，同时gRNA还需要一段结合Cas9 必需的scaffold序列(支架序列)，可选择本领域常规的序列，在本专利技术中为 SEQ ID NO.6所示。通过gRNA的引导，在目标靶点位置实现单碱基C
→
T的突变，从而使靶点位置均突变出终止密码子，导致Kanamycin无法正常表达，丢失Kanamycin抗性。
[0013]本专利技术中，支架序列为：
[0014]SEQ ID NO.6：
[0015]GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGT TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。
[0016]同时，本专利技术还提供了所述敲除Kan抗性基因的SURE菌株的构建方法，包括：
[0017]步骤1、构建可调控质粒丢失的基因元件和包含针对SURE基因组中 Kanamycin抗性基因的单碱基编辑系统的载体；
[0018]步骤2、将步骤1所述基因元件插入到所述载体中，获得重组载体；
[0019]步骤3、将所述重组载体转化至SURE菌株中进行敲除，获得Kanamycin 抗性敲除的Sure菌株；
[0020]步骤4、启动可调控手段控制所述基因元件，使Kanamycin抗性敲除的 Sure菌株中的重组载体丢失，获得纯净的Kanamycin抗性敲除的Sure菌株。
[0021]为了在敲除Kanamycin抗性基因后能够获得纯净的Sure菌株，本专利技术构建方法通过构建诸如温敏型复制子的方式来调控质粒丢失，后期通过控制温度即可使转化的重组载体丢失。在本专利技术具体实施方式中，所述温敏型复制子为pSC101 ori&repA101，以pCas
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DC133质粒(图谱见图1)为模板可以扩增出目标复制子，将该温敏型复制子替换单碱基编辑系统所在载体的复制子。
[0022]构建包含针对SURE基因组中Kanamycin抗性基因的单碱基编辑系统的载体，可在市售载体pUC19质粒基础上添加转录gRNA的序列(SEQ ID NO.4 和SEQ ID NO.5所示)、dCas9
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PmCDA1
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UGI的表达序列，如本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种敲除Kan抗性基因的SURE菌株，其特征在于，由单碱基编辑系统敲除SURE基因组中的Kanamycin抗性基因。2.根据权利要求1所述SURE菌株，其特征在于，所述单碱基编辑器系统的gRNA序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述SURE菌株，其特征在于，所述单碱基编辑系统为基于dCas9
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PmCDA1
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UGI的单基因编辑系统。4.权利要求1所述SURE菌株的构建方法，其特征在于，包括：步骤1、构建可调控质粒丢失的基因元件和包含针对SURE基因组中Kanamycin抗性基因的单碱基编辑系统的载体；步骤2、将步骤1所述基因元件插入到所述载体中，获得重组载体；步骤3、将所述重组载体转化至SURE菌株中进行敲除，获得Kanamy...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈书元，李中万，周智，叶国杰，吴振华，王立军，
申请(专利权)人：杭州嘉因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：