大载体和用于高产量生产的方法技术

本文提供了用于从细菌细胞产生大小至少为16kb的载体的方法，其包括以下连续步骤：a)获得包含大小至少为16kb的载体的细菌细胞，所述载体包含诱导型复制起点，b)用包含载体的细菌细胞接种培养基，c)在培养基中培养细菌细胞，d)当细菌培养物在600nm处的光密度(OD

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】大载体和用于高产量生产的方法


[0001]本专利技术涉及载体和用于高产量生产大载体的方法。

技术介绍

[0002]基因治疗和DNA疫苗是预防、治疗和治愈疾病例如癌症和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的有前途的工具。基因治疗和DNA疫苗需要大量高度纯化的质粒DNA(pDNA)，这些质粒DNA在结构形式和DNA序列方面应该是均质的。此外，基因治疗和DNA疫苗，例如针对复杂病原体的DNA疫苗，需要能够耐受大基因组DNA插入片段的质粒。对于生物制药用途，产量和质量是质粒制造方法的主要驱动力。为了追求产量的增加，开发了可产生高拷贝数的质粒，这意味着它们将导致每个细胞产生多个质粒拷贝(每个细胞＞500个拷贝，例如pUC18、pUC19载体)。使用小质粒(＜10kb)可以实现每个细胞中如此高的质粒拷贝。然而，质粒越大，由于对细菌细胞的高代谢负荷，复制就越慢。细菌细胞将通过将突变引入质粒来应对代谢负荷。结果，质粒DNA的质量将降低。这可以通过使用低拷贝数载体来优化，例如细菌人工染色体(BAC、)，这是维持大基因组DNA片段的优选质粒，因为它们可以在宿主细胞中在单拷贝(SC、)载体中稳定地维持单个DNA片段，即使经过100多代连续细菌生长。
[0003]最近的进展涉及BAC拷贝数的优化。例如，WO2014174078描述了包含诱导型细菌复制起点(ori)序列的BAC，用于将BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝。然而，这些BAC不允许获得高的、商业上可行的BAC产量。因此，需要非常大规模的培养物来获得大量的BAC。
[0004]开发新的载体和方案以获得高产量的高质量质粒至关重要。
[0005]本领域已经描述了在细菌中对包含诱导型细菌复制起点(ori)序列的载体的条件扩增。扩增的诱导通常在细菌的早期指数生长期进行，更具体地，在细菌生长曲线的早期对数(算数)阶段(即低OD)进行(Wild等人2002，Genome Research 12：1434
‑
1444)。

技术实现思路

[0006]本专利技术人发现，使用在达到最佳发酵条件之前将每个细胞的质粒数量保持在低水平的可诱导系统并且随后将系统切换到高拷贝状态，使细菌细胞暴露于高代谢负荷的情况最小化。结果，可以获得更高产量的大质粒并且大质粒具有高质量。
[0007]本专利技术的第一方面提供了用于从细菌细胞产生大小至少为16kb的载体的方法，所述方法利用包含诱导型复制起点的载体，由此当细菌细胞达到OD为至少20时进行诱导。在特定实施方案中，提供了用于从细菌细胞产生大小至少为16kb的载体的方法，其包括以下连续步骤：
[0008]a)获得包含大小为至少16kb的载体的细菌细胞，所述载体包含诱导型复制起点，
[0009]b)用包含载体的细菌细胞接种培养基，
[0010]c)在培养基中培养细菌细胞，直到在600nm处的光密度(OD
600
)达到至少20，
[0011]d)将所述诱导型复制起点的一种或多种诱导剂添加到培养基中，
[0012]e)任选地从培养基中分离细菌细胞，和
[0013]f)从细菌细胞中回收质粒。
[0014]应当理解，在步骤(d)之后继续培养细胞以允许产生质粒。
[0015]更特别地，本专利技术的方法包括在培养基中培养细菌细胞，并且当细菌培养物在600nm的光密度(OD
600
)达到至少20时，将所述诱导型复制起点的一种或多种诱导剂添加到培养基中，之后在培养基中进一步培养细菌细胞。任选地，然后从培养基中分离细菌细胞，并从细菌细胞中回收质粒。
[0016]在特定实施方案中，该方法进一步包括在已经添加所述诱导型复制起点的一种或多种诱导剂之后，例如在步骤d)之后和步骤e)之前，将细菌蛋白质合成抑制剂添加到培养基中。
[0017]在特定实施方案中，在培养基中培养细菌细胞期间，将葡萄糖和/或酵母提取物添加到培养基中。
[0018]在特定实施方案中，在将质粒复制的一种或多种诱导剂添加到培养基之前至少30分钟，将包含葡萄糖的培养基更换为包含0.50％(v/v)至2.0％(v/v)甘油的培养基。
[0019]在特定实施方案中，步骤c)在培养基中培养细菌细胞在约30℃的温度下进行，并且其中在将质粒复制的一种或多种诱导剂添加到培养基中之前至少两小时，将温度从约30℃的温度升高至温度36.0℃至38.0℃。
[0020]在特定实施方案中，诱导型复制起点包含至少一个LacO1操纵基因，并且所述诱导型复制起点的诱导剂是异丙基β
‑
D
‑1‑
硫代半乳糖苷(isopropyl β
‑
D
‑1‑
thiogalactopyranoside)(IPTG)和/或α
‑
D
‑
乳糖。
[0021]在特定实施方案中，细菌蛋白质合成抑制剂是氯霉素或壮观霉素，优选氯霉素。
[0022]在特定的实施方案中，在添加诱导型复制起点的一种或多种诱导剂后至少一小时，将细菌蛋白质合成抑制剂添加到培养基中。
[0023]在特定的实施方案中，在添加诱导型复制起点的一种或多种诱导剂后最多6小时，将细菌细胞从培养基中分离出来。
[0024]另一方面提供了大小至少为16kb的载体，其包含诱导型复制起点。
[0025]在特定实施方案中，诱导型复制起点包括pMBl复制起点：
[0026]‑
其中RNAI启动子被缺失或突变，使得RNAI启动子的功能被消除或显著降低，从而获得截短的RNAII前引物；和
[0027]‑
其中编码RNAI的核酸序列被缺失或突变，使得RNAI的功能被消除或显著降低，从而获得截短的RNAII前引物；和
[0028]‑
其中至少一个LacO1操纵基因被引入编码截短的RNAII前引物的核酸序列的上游，其中至少一个LacO1操纵基因可操作地连接到编码截短的RNAII前引物的核酸序列。
[0029]在特定实施方案中，pMB1复制起点的内源性RNAII启动子被不是pMB1复制起点的RNAII前引物的内源性启动子的启动子替换，并且其中不是pMB1复制起点的RNAII前引物的内源性启动子的所述启动子与至少一个LacO1操纵基因可操作地连接。
[0030]在特定实施方案中，pMBl ori的内源性RNAII启动子被选自由以下组成的组的启动子替换：RNAI的启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子或T7启动子，优选lac启动子，更优选L8/UV5 lac启动子。
[0031]另一方面提供了诱导型复制起点，其包含pMBl复制起点：
[0032]‑
其中RNAI启动子被缺失或突变，使得RNAI启动子的功能被消除或显著降低，从而获得截短的RNAII前引物；和
[0033]‑
其中编码RNAI的核酸序列被缺失或突变，使得RNAI的功能被消除或显著降低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于从细菌细胞产生大小至少为16kb的载体的方法，其包括以下连续步骤：a)获得包含大小为至少16kb的载体的细菌细胞，所述载体包含诱导型复制起点，b)用包含载体的细菌细胞接种培养基，c)在培养基中培养细菌细胞，d)当细菌培养物在600nm处的光密度(OD
600
)达到至少20时，向培养基中加入所述诱导型复制起点的一种或多种诱导剂，e)进一步在培养基中培养所述细菌细胞，f)任选地从培养基中分离所述细菌细胞，和g)从所述细菌细胞中回收质粒。2.根据权利要求1所述的方法，还包括在步骤d)之后和步骤f)之前向培养基中添加细菌蛋白质合成抑制剂。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在培养基中培养所述细菌细胞期间，将葡萄糖和/或酵母提取物添加到培养基中。4.根据权利要求3所述的方法，其中在将质粒复制的一种或多种诱导剂添加至培养基之前至少30分钟，将包含葡萄糖的培养基更换为包含0.50％(v/v)至2.0％(v/v)甘油的培养基。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤c)在培养基中培养细菌细胞在约30℃的温度下进行，并且其中在将质粒复制的一种或多种诱导剂添加到培养基中之前至少两小时，将温度从约30℃的温度升高至温度36.0℃至38.0℃。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述诱导型复制起点包含至少一个LacO1操纵基因，并且所述诱导型复制起点的诱导剂是异丙基β
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D
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硫代半乳糖苷(IPTG)和/或α
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D
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乳糖。7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述细菌蛋白质合成抑制剂为氯霉素或壮观霉素，优选地氯霉素。8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中在将诱导型复制起点的一种或多种诱导剂添加到培养基至少一小时后，将细菌蛋白质合成抑制剂添加到培养基中。9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中在将诱导型复制起点的一种或多种诱导剂添加到培养基中至多6小时后，将细菌细胞从培养基中分离。10.大小至少为16kb的载体，其包含诱导型复制起点，其中所述诱导型复制起点包括pMB1复制起点：
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其中RNAI启动子被缺失或突变，使得R...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅洛迪，
申请(专利权)人：鲁汶天主教大学，
类型：发明
国别省市：