一株来源于溶藻弧菌噬菌体的裂解酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了噬菌体的裂解酶基因holA和lysin的共表达载体、共表达载体的重组菌株、噬菌体共表达裂解酶holA

【技术实现步骤摘要】
一株来源于溶藻弧菌噬菌体的裂解酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一株来源于溶藻弧菌噬菌体的裂解酶及其应用。

技术介绍

[0002]溶藻弧菌是水产养殖中重要的条件致病菌，对海水养殖业造成了极大的危害。此外，该弧菌也可引起人类的一些病症，如造成五官和胃肠道的感染，引起中耳炎和食物中毒等。近年来，随着水产养殖模式由粗放化向高密度集约化的快速转变，导致病害频发。使用抗生素及化学消毒剂等传统的治疗方法产生了诸多问题，例如细菌产生耐药性、病原菌传播引发安全问题、养殖水环境微生态失衡、人类生存环境遭受破坏等。这些问题进而由弧菌等细菌性病原引发的水生动物病害难以有效治疗，成为制约水产养殖业可持续发展的一个关键性因素。因此，迫切需要寻找一种安全、有效的防控策略，以提高水产养殖成功率、水产品质量和安全性。
[0003]噬菌体广泛存在于环境中，是以真菌、细菌等微生物为宿主的病毒，因具有特异性高、对人体无副作用等优点被广泛关注，但是噬菌体作为一个独立的生命体在用作抗菌制剂时会产生抗噬菌体菌株，且生物安全性一直受到质疑。噬菌体裂解酶是dsDNA噬菌体在感染细菌后期表达的一种水解酶。与噬菌体相比，裂解酶具有不易使细菌产生耐药性、能杀死在黏膜表面定植病原菌、且宿主谱相对较广等优点。因此，噬菌体裂解酶具有巨大的应用前景。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了噬菌体的裂解酶基因holA和lysin的共表达载体。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是提供了含有所述的共表达载体的重组菌株。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了噬菌体裂解酶holA
‑
lysin及其制备方法。
[0007]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了所述的共表达载体、所述的重组菌株、所述的噬菌体裂解酶holA
‑
lysin在溶藻弧菌裂解中的应用。
[0008]本专利技术还提供了噬菌体共表达裂解酶holA
‑
lysin对裂解大肠杆菌及不同来源的溶藻弧菌的裂解效果评价方法。
[0009]本专利技术的目的是通过寻找新的可抑制或杀死溶藻弧菌等水产病原弧菌的噬菌体裂解酶，以期减少和替代抗生素的使用。本专利技术利用生物技术手段在大肠杆菌和溶藻弧菌中共表达噬菌体HH109的裂解酶holA和lysin基因，证明它们的表达能够高效地裂解大肠杆菌及溶藻弧菌，可作为潜在的新型生物制剂用于防治由病原菌溶藻弧菌引起的水生动物疾病。
[0010]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了噬菌体的裂解酶基因holA和lysin的共表达载体，所述共表达载体通过将噬菌体基因组DNA作为模板，分别以基因holA
的引物对和基因lysin的引物对进行PCR扩增，得到基因holA片段和基因lysin片段，将基因holA片段和基因lysin片段融合，然后与载体连接即得。
[0011]其中，所述噬菌体为噬菌体HH109。
[0012]其中，所述基因holA的引物对包括上游引物holA
‑
F1和下游引物holA
‑
R1；或上游引物holA
‑
F2和下游引物holA
‑
R2；其中，所述上游引物holA
‑
F1序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物holA
‑
R1序列如SEQ ID NO：2所示，所述上游引物holA
‑
F2序列如SEQ ID NO：5所示，所述下游引物holA
‑
R2序列如SEQ ID NO：6所示。
[0013]其中，所述基因lysin的引物对包括上游引物lysin
‑
F1和下游引物lysin
‑
R1；或上游引物lysin
‑
F2和下游引物lysin
‑
R2，其中，所述上游引物lysin
‑
F1序列如SEQ ID NO：3所示，所述下游引物lysin
‑
R1序列如SEQ ID NO：4所示，所述上游引物lysin
‑
F2序列如SEQ ID NO：7所示，所述下游引物lysin
‑
R2序列如SEQ ID NO：8所示。
[0014]其中，所述载体为pET32a或pMMB207。
[0015]本
技术实现思路
还包括含有所述的共表达载体的重组菌株。
[0016]其中，所述重组菌为大肠杆菌BL21、溶藻弧菌菌株E110和不敏感溶藻弧菌E601或HN198菌株中的一种。
[0017]本
技术实现思路
还包括噬菌体裂解酶holA
‑
lysin，所述噬菌体裂解酶holA
‑
lysin是将所述的重组菌株进行诱导表达后得到。
[0018]本
技术实现思路
还包括噬菌体裂解酶holA
‑
lysin的制备方法，包括以下制备步骤：将所述的重组菌株进行诱导表达后得到。
[0019]本
技术实现思路
还包括所述的共表达载体、所述的重组菌株、所述的噬菌体裂解酶holA
‑
lysin在细菌裂解中的应用。
[0020]其中，所述细菌为大肠杆菌或溶藻弧菌。
[0021]本
技术实现思路
还包括噬菌体裂解酶基因holA和lysin共表达对大肠杆菌及溶藻弧菌的裂解效果评价中的应用，包括以下步骤：
[0022]1)扩增噬菌体HH109的裂解酶holA和lysin基因，与表达质粒相连，并分别转入大肠杆菌及溶藻弧菌获得穿孔素holA和内溶素lysin基因共表达的菌株；
[0023]2)培养所述含有holA和lysin重组质粒的大肠杆菌或溶藻弧菌至菌液的OD
600
为0.6
‑
0.8，用0.5mMIPTG诱导8h后，分光光度计测定菌液OD
600
，绘制细菌生长曲线；
[0024]3)0.5mM IPTG诱导含有质粒pET32a
‑
holA
‑
lysin的大肠杆菌4h，离心后取500μL培养液上清，加入100μL 20mM的ONPG，45℃，水浴反应30min，随后加入600μL 0.5M Na2CO3停止反应；
[0025]4)IPTG诱导包含质粒pET32a
‑
holA
‑
lysin的大肠杆菌4h后，收集菌体并使用透射电子显微镜观察大肠杆菌形态变化。
[0026]5)使用GeneCopoeia公司的细胞荧光染料对IPTG诱导后4h后含pMMB207
‑
holA
‑
lysin溶藻弧菌进行染色，NucViewGreen可以将活细胞染为绿色，Propidiumiodide可以将死细胞染为红色，荧光显微镜观察菌株颜色判断菌株被裂解效率。
[0027]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.噬菌体的裂解酶基因holA和lysin的共表达载体，其特征在于，所述共表达载体通过将噬菌体基因组DNA作为模板，分别以基因holA的引物对和基因lysin的引物对进行PCR扩增，得到基因holA片段和基因lysin片段，将基因holA片段和基因lysin片段融合，然后与载体连接即得。2.根据权利要求1所述的噬菌体的裂解酶基因holA和lysin的共表达载体，其特征在于，所述噬菌体为噬菌体HH109，所述载体为pET32a或pMMB207。3.根据权利要求1所述的噬菌体的裂解酶基因holA和lysin的共表达载体，其特征在于，所述基因holA的引物对包括上游引物holA
‑
F1和下游引物holA
‑
R1；或上游引物holA
‑
F2和下游引物holA
‑
R2；其中，所述上游引物holA
‑
F1序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物holA
‑
R1序列如SEQ ID NO：2所示，所述上游引物holA
‑
F2序列如SEQ ID NO：5所示，所述下游引物holA
‑
R2序列如SEQ ID NO：6所示。4.根据权利要求1所述的噬菌体的裂解酶基因holA和lysin的共表达载体，其特征在于，所述基因lysin的引物对包括上游引物lysin
‑
F1和下游引物lysin
‑<...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵哲，李席席，喻飞，张策，史燕，魏富成，吴颖，
申请(专利权)人：河海大学，
类型：发明
国别省市：