启动子筛选方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及启动子筛选方法。本发明专利技术提供了基因元件组合、表达载体以及ITR在启动子筛选和/或制备兼容AAV包装的双荧光素筛选载体中的应用。本发明专利技术在传统双荧光筛选系统的基础上，融合AAV包装系统，可以用一个载体同时实现质粒层面和病毒层面筛选，大大减少了启动子筛选周期。同时，因为ITR序列具有一定的启动子和增强子活性，所以加入ITR序列进行启动子的筛选更加符合基因疗法工作的真实情况。本发明专利技术在基因疗法启动子筛选、基因表达鉴定上具有很好的应用价值。因表达鉴定上具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
启动子筛选方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及启动子筛选方法。

技术介绍

[0002]基因疗法是一种通过将治疗性遗传物质转移到靶细胞来治疗某些疾病的方法。近年来，基因治疗研究发展迅速，在多种罕见病中表现优异，是一种理想的治疗方法。
[0003]基因治疗的三个要素包括靶细胞、核酸和转移方法。因此，在基因治疗过程中，选择合适的载体，可控有效的表达，是成功的关键。
[0004]1)合适的载体：腺相关病毒三质粒表达系统是目前常用的一类AAV载体系统。该套AAV系统包含表达载体、包装质粒和辅助质粒。其中表达载体是AAV病毒的核心，包含了ITR序列、CMV启动子，多克隆位点等，用于携带外源基因；包装质粒负责表达AAV病毒的结构蛋白，决定AAV的血清型和组织嗜性。腺相关病毒具有表达滴度高、宿主免疫反应轻微、感染谱广、安全性高等优势，成为近年来在基因治疗领域应用广泛的病毒载体之一。
[0005]2)可控有效的表达：而可控有效的表达就需要一个特异性高、强度大的启动子。根据启动子的表达特征，通常将启动子分为组成型启动子、诱导型启动子以及器官/组织特异性启动子，这些启动子各具特色，选择一种特异性相对更强的启动子尤为重要。
[0006]但传统的启动子筛选过程中，不同阶段需要用到不同的质粒，使得启动子筛选的操作繁琐、周期较长。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供的启动子筛选方法，同时实现质粒层面和病毒层面筛选，大大减少了启动子筛选周期。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了反向末端重复序列在如下方面的应用：
[0010](I)、启动子筛选；和/或
[0011](II)、制备兼容AAV包装的双荧光素筛选载体。
[0012]本专利技术还提供了基因元件组合，包括荧光素酶基因1、荧光素酶基因2和反向末端重复序列，所述荧光素酶基因1与所述荧光素酶基因2不相同；
[0013]所述荧光素酶基因1包括萤火虫荧光素酶；和/或
[0014]所述荧光素酶基因2包括海肾荧光素酶。
[0015]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述基因元件组合还包括复制起点、启动子、终止子、嵌合内含子或抗性基因中的一种或多种。
[0016]本专利技术还提供了上述基因元件组合在制备兼容AAV包装的双荧光素筛选载体中的应用。
[0017]本专利技术还提供了表达载体，包括上述基因元件组合，以及可接受的其他基因元件。
[0018]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述表达载体具有：
[0019](1)、如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或
[0020](2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
[0021](3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
[0022]所述多个为2个至300个。
[0023]本专利技术还提供了上述表达载体在制备启动子筛选的试剂或试剂盒中的应用。
[0024]本专利技术还提供了启动子的筛选方法，包括基于上述表达载体进行筛选；
[0025]所述筛选包括：
[0026](i)、通过双荧光素筛选方法进行筛选；和/或
[0027](ii)、通过包装为AAV进行动物实验的方式进行筛选。
[0028]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述筛选方法包括如下步骤：
[0029]步骤(A)：以待测启动子替换上述表达载体中的启动子，获得待测表达载体；
[0030]步骤(B)：将步骤(A)所述待测表达载体转染至细胞，培养，进行双荧光素酶检测，获得检测结果1；
[0031]步骤(C)：取步骤(A)所述待测表达载体、AAV包装质粒和AAV辅助质粒转染至细胞，培养，获得病毒液，取所述病毒液施用于实验动物，对所述实验动物进行活体成像，获得检测结果2；
[0032]步骤(D)：根据步骤(B)所述检测结果1和步骤(C)所述检测结果2，比较不同所述待测表达载体的表达量，获得优选启动子，达到筛选的目的。
[0033]在本专利技术的一些具体实施方案中，上述筛选方法中步骤(A)所述的替换包括通过双酶切的方法替换，其中，酶切位点为MluI和BamHI。
[0034]本专利技术的表达载体和方法有如下效果：
[0035]本专利技术以pIDL
‑
CK8e进行了验证实验，其在C2C12细胞上的Firefly/Renilla Ratio为7.04
±
0.4；在H9C2细胞上的Firefly/Renilla Ratio为2.02
±
0.04。
[0036]小鼠活体成像结果图表可知，pIDL
‑
CK8e质粒包装成的AAV
‑
CK8e注射进小鼠体内后可以正常表达luciferase，并且表达部位集中在小鼠后腿的肌肉处，肝脏仅有极少量分布，体现了CK8e启动子极强的特异性，数据为300.015
±
81.23。
[0037]实验表明pIDL
‑
CK8e在质粒转染层面和AAV感染动物层面都取得了与预期相符的结果，证明该双荧光筛选方法可以用于高通量、快速的启动子筛选。
附图说明
[0038]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0039]图1示pSiCHECK
‑
2质粒结构；
[0040]图2示pEXG106
‑
101K质粒结构；
[0041]图3示pIDL
‑
CBA质粒结构；
[0042]图4示pIDL
‑
CK8e质粒结构；
[0043]图5示pIDL
‑
ZJT构建流程图；
[0044]图6示pIDL
‑
CBA构建流程图；
[0045]图7示pIDL
‑
CK8e构建流程图；
[0046]图8示CYP4V2 mRNA序列；
[0047]图9示不同长度启动子的载体设计；
[0048]图10示pEXG106
‑
EX质粒结构；
[0049]图11A示pIDL
‑
CBA测序结果；
[0050]图11B示pIDL
‑
CBA测序结果；
[0051]图12示pIDL
‑
CK8e测序结果；
[0052]图13示pIDL
‑
CK8e转染不同细胞双荧光检测结果；
[0053]图14示AAV9 BALB/cJ小鼠活体成像；
[0054]图15示不同长度启动子双荧光结果；其中，A示启动子长度筛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.反向末端重复序列在如下方面的应用：(I)、启动子筛选；和/或(II)、制备兼容AAV包装的双荧光素筛选载体。2.基因元件组合，其特征在于，包括荧光素酶基因1、荧光素酶基因2和反向末端重复序列，所述荧光素酶基因1与所述荧光素酶基因2不相同；所述荧光素酶基因1包括萤火虫荧光素酶；和/或所述荧光素酶基因2包括海肾荧光素酶。3.如权利要求2所述的基因元件组合，其特征在于，还包括复制起点、启动子、终止子、嵌合内含子或抗性基因中的一种或多种。4.如权利要求2或3所述的基因元件组合在制备兼容AAV包装的双荧光素筛选载体中的应用。5.表达载体，其特征在于，包括如权利要求2或3所述的基因元件组合，以及可接受的其他基因元件。6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，具有：(1)、如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至300个。...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈书元，贺晨涛，姜玉玲，叶国杰，吴振华，王立军，
申请(专利权)人：杭州嘉因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：