一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法技术

本发明专利技术公开了一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法，该方法为对若干例患者在治疗前和服用待测药物进行治疗结束后24小时的血清外泌体代谢物进行分析，分析治疗前和治疗结束后的差异代谢物分子，从差异代谢物分子中筛选出表现最好的一种或多种为肝细胞癌患者药物敏感性代谢分子标志物。本发明专利技术可以发现药物敏感性代谢分子标志物。明可以发现药物敏感性代谢分子标志物。明可以发现药物敏感性代谢分子标志物。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法。

技术介绍

[0002]肿瘤细胞之间以及肿瘤细胞与微环境中基质细胞之间的通讯促进了肿瘤细胞的转移，导致患者的生活质量降低，救治难度加大，甚至死亡。来自肿瘤细胞和基质细胞外泌体通过在细胞之间转运其内容物(mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白质和脂质代谢分子)在肿瘤的发生发展和转移过程中发挥了举足轻重的作用。
[0003]外泌体(exosomes)是细胞经过“内吞
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融合
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外排”等一系列调控过程而形成的膜性囊泡，直径约为30
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150nm，密度在1.13
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1.21g ml
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1，天然存在于血液、唾液、尿液及母乳等体液中。人体中大约有1014个外泌体，大约平均每个细胞产生1000
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10000个。外泌体中含有核酸(DNA、miRNA、lncRNA、mRNA、tRF等)、蛋白质和氨基酸、糖、维生素、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、神经酰胺等代谢分子，在细胞间物质和信息转导中发挥重要作用，研究表明其在免疫调控、肿瘤转移、血管生成以及生物标志物等领域都发挥着不可替代的作用。从外泌体这一微环境角度可以更好地解释细胞间通讯的传导，揭示疾病作用机制，同时寻找疾病诊断和预后的分子标志物，用于疾病的早诊和分型等。
[0004]肝细胞癌(HCC)是临床最常见的原发性肝癌和一种常见的致命性的恶性肿瘤，是全世界癌症死亡的主要原因之一，全世界每年大约有81万肝细胞癌患者死亡。其中中国的死亡人数占50％以上，平均每5min就有3人死于肝细胞癌。HCC的常见症状可分为肿瘤相关症状和肝功能失代偿导致的症状。HCC高危人群主要包括：具有乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)或丙型肝炎病毒(HepatitisC virus，HCV)感染、过度饮酒、非酒精性脂肪性肝炎、长期食用被黄曲霉毒素污染的食物、以及有肝癌家族史等人群，尤其是年龄>40岁的男性风险更大。
[0005]HCC治疗手段的选择取决于肿瘤位置、病变范围、是否转移及肝功能等因素。手术是唯一有可能治愈HCC的方法，包括肝脏部分切除和原位肝移植等。根治性手术切除目前仍是符合条件患者的标准治疗选择，但许多患者的预后仍然很差，术后五年内的复发风险通常超过50％。一项关于肝细胞癌根治性肝切除术后复发的动态风险预测研究共纳入了486位HCC患者，发现在术后5年内至少发生一次肝内复发的几率为31％，远处转移的几率为16.3，死亡的几率为19.8％。为了降低治愈性手术后的复发风险，可采用辅助治疗和新辅助治疗，包括新辅助局部治疗(经动脉化疗栓塞术、肝动脉灌注化疗和外照射放射治疗)和新辅助全身治疗(阻断剂、单抗和免疫检查点抑制剂)。
[0006]系统或局部姑息手段常用于因肝功能较差难以耐受手术或因肿瘤多发不能手术的患者，或在等待肝移植过程中控制肿瘤生长。目前临床治疗不可手术HCC的一线治疗药物主要有获得FDA批准的索拉菲尼(Sorafenib)和乐伐替尼(Lenvatinib)。索拉菲尼是一种阻断Raf激酶、血管内皮生长因子受体(VEGFR)与血小板衍生化生长因子受体(PDGFR)的多重
酪氨酸激酶抑制剂。尽管索拉菲尼在治疗安全性与有效性存在不足，它仍是近15年内唯一用于晚期HCC全身治疗的药物。乐伐替尼作为新型的酪氨酸激酶抑制剂，其作用靶点包括VEGFR 1
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3、成纤维细胞生长因子受体(FGFR 1
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4)、PDGFRa与RET，其疗效与索拉菲尼相比没有显著性改善。当患者病情出现恶化，或对索拉菲尼/乐伐替尼出现不耐受性和抗药性时，二线治疗是改善HCC患者整体生存质量的有效治疗手段。《Perez M,et al.Dynamic risk profiling of hepatocellular carcinoma recurrence after curative intent liver resection Hepatology》公开了目前二线治疗包括瑞戈非尼(Regorafenib)、卡博替尼(Cabozantinib)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、依维莫司(Everolimus)、阿西替尼(Axitinib)和布立尼布(Brivanib)的靶向治疗以及免疫关卡抑制剂(PD
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L1)和嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)的免疫治疗。文献《The Role of Extracellular Vesicles as Shuttles of RNA and Their Clinical Significance as Biomarkers in Hepatocellular Carcinoma》中，Neri详细报道了外泌体中非编码RNA(ncRNA)在HCC发生的肿瘤细胞形成、血管再生和肿瘤细胞转移过程中的作用，认为外泌体ncRNA作为HCC诊断与预后标志物的前景广阔。
[0007]虽然免疫治疗的兴起为肝细胞癌的治疗提供了新途径，其实用价值亦得到越来越多的肯定和关注，但是目前有效治疗HCC的包括阻断剂、单抗、免疫关卡抑制剂和CAR
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T的药物仍然匮乏，HCC患者在临床治疗效果也存在较大差异。而药物治疗过程中产生的耐药性一方面制约了各类药物在HCC治疗的广泛应用，另一方面由于HCC患者对药物治疗敏感性不一，亟待发现针对药物治疗敏感性的生物标志物为制定HCC个性化治疗方案提供科学依据。

技术实现思路

[0008]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法。
[0009]本专利技术采用的技术方案是：
[0010]本专利技术提供了一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法，该方法为对若干例患者在治疗前和服用待测药物进行治疗结束后24小时的血清外泌体代谢物进行分析，分析治疗前和治疗结束后的差异代谢物分子，从差异代谢物分子中筛选出表现最好的一种或多种为肝细胞癌患者药物敏感性代谢分子标志物。
[0011]进一步地，其包括以下步骤，1)患者治疗前，获取患者的血清，提取外泌体代谢物；2)获取患者服用待测药物进行治疗结束后24小时的血清，提取外泌体代谢物；3)对比步骤1)和2)外泌体代谢物，使用三重四级杆质谱确定差异代谢物分子；4)筛选得出肝细胞癌患者药物敏感性代谢分子标志物。
[0012]进一步地，所述差异代谢物分子包括氨基酸、糖类或脂质。
[0013]进一步地，步骤1)和2)中，使用高速离心机对患者血清进行外泌体分离，将分离得到的外泌体经超声破壁和甲醇提取后，得到外泌体代谢物。
[0014]进一步地，步骤3)中，用三重四级杆质谱确定差异代谢物分子确定差异代谢物分子，包括20种上调代谢物和20种小调差异代谢物分子。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法，其特征在于，对若干例患者在治疗前和服用待测药物进行治疗结束后24小时的血清外泌体代谢物进行分析，分析治疗前和治疗结束后的差异代谢物分子，从差异代谢物分子中筛选出表现最好的一种或多种为肝细胞癌患者药物敏感性代谢分子标志物。2.根据权利要求1所述的一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法，其特征在于，其包括以下步骤，1)患者治疗前，获取患者的血清，提取外泌体代谢物；2)获取患者服用待测药物进行治疗结束后24小时的血清，提取外泌体代谢物；3)对比步骤1)和2)外泌体代谢物，使用三重四级杆质谱确定差异代谢物分子；4)筛选得出肝细胞癌患者药物敏感性代谢分子标志物。3.根据权利要求1所述的一种用于肝细胞癌药物敏感性检测的外泌体标志物获取方法，其特征在于，所述差异代谢物分子包括氨基酸、糖类或脂质。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李挥，周丽，刘华，甄晓兰，齐佳钰，
申请(专利权)人：河北省药品医疗器械检验研究院河北省化妆品检验研究中心，
类型：发明
国别省市：