本发明专利技术公开了用于四氢大麻酚检测及抗体制备的完全抗原。本发明专利技术还公开了用该完全抗原制备的抗四氢大麻酚单克隆抗体，以及胶体金标记四氢大麻酚单抗免疫检测板，以用于检测药品或尿样等人体标本中的四氢大麻酚。与ＨＰＬＣ等方法相比，本发明专利技术的检测板简单、轻便，易于携带，可以现场检测，而且不需要昂贵的设备。使用本发明专利技术的检测板检测四氢大麻酚，整个测试可在１．５ｍｉｎ内完成，检测的灵敏度可达０．５ｎｇ，且与６０多种常见药物、毒品、四氢大麻酚体内代谢物没有交叉反应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子免疫学和毒物学领域。具体而言，本专利技术涉及违禁药品的检测，尤其涉及四氢大麻酚的酶联免疫检测。
技术介绍
当前，毒品犯罪形势十分严峻。毒品种类多，仅据联合国2004年统计，全世界吸毒人员已超过2亿人，其中至少1.4亿人以上吸食大麻，900万人以上吸食海洛因，1300万人以上吸食可卡因，吸食苯丙胺等其他人工合成毒品更是难以计数。目前我国吸毒人数持续上升，我国登记在册的吸毒人员超过百万，青少年吸毒者急剧增加。受毒范围不断扩大，出现制毒、贩毒、吸毒现象的县市占全国县市总数的四分之三以上。大麻(Cannabis或Marijuana)是国际国内严格管制的麻醉药品，成瘾性强。大麻是从大麻植物中提取的一种酚类衍生物的总称，其主要含有四氢大麻酚、大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚酸等，其中以四氢大麻酚(Tetrahydrocarmabinol， A9THC或THC)禾B ll-nor- △ 8-四氢大麻酚-9-羧酸(11 一 nor- △ 8-Tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid)为主。四氢大麻酚(THC)是 一 个分子量为314Da的小分子半抗原物质，本身没有免疫原性而只具备免疫反应性。长期以来，人们一直错误的认为吸食大麻是不会像海洛因等毒品容易产生成瘾依赖，这种错误的想法也是导致今天大麻滥用的主要原因之一。长期吸食大麻者，由于蓄积中毒造成行为毒性反应，呈醉酒状，情绪激动，自觉欣快，产生梦幻般的陶醉感，同时发生错觉、幻觉与思维障碍，对人产生敌对的意念，极易发生暴力和自杀倾向，具有极大的社会危害性。现在大麻毒品己引起我国政府的高度重视，必须给予严厉打击。实验室常规检验毒品的方法是仪器分析，但是仪器检验速度慢，分析操作周期较长，购买仪器价格昂贵，需要专门培训，仪器检验成本高(一个样品需400元人民币以上)难以在广大基层单位推广。4虽然国外(如美国等)已开发出了大麻单抗免疫检测板，但其中存在以下二个问 题(l)国内外大麻鉴定主要是依据样品中是否含有四氢大麻酚(THC)，然而国外研发的大麻单克隆抗体只能识别尿样中含量最少的代谢物ll-nor-A8-四氢大麻酚-9 羧酸，无法检测四氢大麻酚(THC); (2)目前大麻单抗免疫检测板灵敏度都在100.0ng 以上，要准确的检测出ll-nor-A8-四氢大麻酚-9羧酸，大麻单抗免疫检测板的灵敏 度必须在10.0ng以下。因此，使用国外进口的大麻单抗免疫检测板检测吸食大麻毒 品人员的尿样一般都是假阴性，使得大量大麻吸毒案子无法侦破。造成这些问题的原因主要是国外使用BSA(牛血清白蛋白)来制备完全抗原(大 麻一BSA)并用其免疫小鼠制备单抗。由于BSA分子量只有40-60万Da,来源与人种属 较接近的动物，因此制备的单克隆抗体效价较低，特异性差。随着与四氢大麻酚相关的刑事案件逐年上升和国家对大麻管理的日趋严格， 本领域对大麻，尤其是四氢大麻酚，和滥用毒品者生物标本中大麻和四氢大麻酚的 检测提出了更高的要求。本领域迫切需要研发一种简便快速、准确可靠、灵敏、价 格便宜适用于犯罪现场对大量检材即时定性筛选和实验室快速检验及基层单位易 掌握的大麻毒品成分检验新方法。
技术实现思路
本专利技术的目的正是提供一种快速、简易、灵敏地检测四氢大麻酚的检测方法 和检测试剂。在本专利技术的第一方面中，提供了一种完全抗原，所述完全抗原具有式l所示的结构<formula>formula see original document page 5</formula>式1其中，A为血蓝蛋白。在本专利技术的第二方面中，提供了一种制备式1所述的完全抗原的方法，所述方法包括步骤(a)使含羟基的化合物首先与琥珀酸酐反应，生成带羧基的中间体；(b) 使步骤(a)所得的中间体与N-羟基琥珀酰亚胺反应，生产的酯键；(c) 使步骤(b)所得产物与血蓝蛋白连接，从而制得式1的完全抗原。在本专利技术的一个优选例中，步骤(a)的条件如下反应温度为0-10(TC，优选室 温-8(TC，更优选30-6(TC;反应时间为l-24小时，优选2-12小时，更优选2-6小时。在另一优选例中，步骤(b)的条件如下反应温度为0-6(TC，优选室温-60。C; 反应时间为l-24小时，优选2-12小时，更优选3小时。在另一优选例中，步骤(c)的条件如下反应温度为0-4(TC，优选4-3(TC;反 应pH为3.0-8.0;反应时间为1-24小时，优选6-12小时，更优选6小时。在本专利技术的第三方面中，提供了一种本专利技术前述的半抗原或完全抗原的用途， 其用于制备四氢大麻酚特异性单克隆抗体。在一个优选例中，所述方法包括步骤在本专利技术的第三方面中，提供了本专利技术完全抗原的用途，其用于制备四氢大麻 酚特异性单克隆抗体。在本专利技术的第四方面中，提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合 于四氢大麻酚。在本专利技术的一个优选例中，所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系THC-KLH-CH1所产生。在另一优选例中，所述的单克隆抗体与四氢大麻酚的结合效价大于1: 6000， 更佳地大于1:8000，最优选大于1: 10000。在另一优选例中，所述的单克隆抗体 仅结合于与大麻的酚类衍生物11-nor-A8-四氢大麻酚-9羧酸，11-羟-A9-四氢大麻 酚，A8-四氢大麻酚，A9-四氢大麻酚，大麻酚，大麻二酚，发生免疫结合反应。在本专利技术的第五方面中，提供了一种产生本专利技术单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系是小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO. C200915(即大麻单抗细胞株 THC10A，于2009年2月20日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国， 武汉，武汉大学))。在本专利技术的第六方面中，提供了一种本专利技术单克隆抗体的用途，其用于制备检 测样品中四氢大麻酚的试剂、检测板或试剂盒。在本专利技术的一个优选例中，所述样品是生物样品，且优选为血样或尿样。 在本专利技术的第七方面中，提供了一种检测生物样品中是否存在四氢大麻酚的 方法，所述方法包括步骤(a) 将样品与本专利技术的单克隆抗体接触；(b) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在四 氢大麻酚。在本专利技术的一个优选例中，所述单克隆抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。在本专利技术的一个优选例中，所述检测方法为胶体金检测法、比色检测法、 或荧光检测法。在本专利技术的第八方面中，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板) 和测试条，所述的测试条含有前述的单克隆抗体。在另一优选例中，所述的测试条还含有完全抗原点样区，所述的完全抗原点样 区含有固定化的式1所示的完全抗原。在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸 依次搭接组成。在另一优选例中，所述层析材料预包被有经胶体金标记或有色标记的本专利技术的 单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜上吸附有检测线和质控线，所述的检测线为式1所示的完全 抗原；所述的质控线为羊抗鼠IgG多抗。所述层析材料预包被有浓度范围为0.01-20.0mg/ml，优选0.1-10.0mg/ml，更优 选为0.2-2.0mg/ml，且包被量为5-150 u 1/cm2，优选10-10本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种完全抗原，其特征在于，所述完全抗原具有式１所示的结构： ＊＊＊ 式１ 其中，Ａ为血蓝蛋白。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾立波，
申请(专利权)人：曾立波，陈连康，胡小龙，张玉荣，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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