本发明专利技术提供了用于△－９－四氢大麻酚（大麻：ＴＨＣ）的高灵敏度检测的竞争性免疫测定技术，它采用大麻生物合成中的中间体的载体缀合物，更具体而言是通过其羟基缀合到大分子载体的５－戊基间苯二酚。通过在侧向流动免疫色谱测试装置中采用这样一种具有抗－ＴＨＣ抗体的缀合物，可以实现便利的用于液体样品中低水平大麻的现场测试。这样的测试特别有利于口腔流体样品中大麻的路边测试。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于生物基质、环境组合物中和表面处的大麻素检测的竞争性免疫测定技术，特别涉及Δ-9-四氢大麻酚(大麻；THC)和相关代谢物。特别地，本专利技术提供了在即时诊断(point-of-care)和现场测试中所用装置的THC的高灵敏度检测的程序。
技术介绍
现在大麻是世界上最广泛滥用的违禁药物(Journal of ChromatographyB，卷733，第119-126页)并且在许多国家它被归为1类或2类禁止的药物。大麻检测由法庭科学家、毒理学家、药物康复临床常规地进行并且作为药物滥用的工作场所测试的部分。近来，根据影响力测试它已经成为针对驾驶的主要违禁药物。Δ-9-四氢大麻酚(THC，见附图说明图1中的结构图I)是植物大麻(Cannabissativa)的开花的或水果的顶端、叶子和树脂中主要的影响精神活动的分析物。THC在人体中广泛地代谢成两种主要产物，11-去甲-9-羧基-Δ-9-THC(THC-COOH，见图1中的结构图II)和11-羟基-Δ-9-THC(THC-OH，见图1中的结构图III)。在这两种代谢物中，只有所述羟基代谢物具有影响精神活动的效果。已知的THC检测方法和已知的大麻检测方法一般可以归为三组。金标准技术采用GS/MS、级联GC/MS/MS、LC/MS和级联LC/MS/MS(GC＝气相色谱法；LC＝液相色谱法；MS＝质谱法)。这些技术是严格基于实验室的并且需要专门的训练和设备，这使它们不适合即时诊断测试。大麻检测的定量方法在本领域中也是已知的。美国专利3715189、4196167、4771005、4816415和5457054，还有英国专利号1426177和其中的参考文献，描述了基于涉及颜色改变化学反应的大麻检测方法。然而，化学方法趋于是非特异性的并且缺乏对于生物基质中药品检测所需要的灵敏度水平。第三组已知的大麻素检测方法采用免疫技术。例如，针对缀合到载体大分子的多种大麻素衍生物产生抗体并且然后利用这些抗体和它们的标记衍生物建立免疫测定法，例如在放射性免疫测定法和荧光免疫测定法中使用的放射性标记的或荧光的衍生物和在多种形式的酶免疫测定法中使用的酶标记的衍生物。这样的酶免疫测定法包括，例如，利用固定化的药物衍生物和酶标记抗体的直接的ELISA法。作为一种备选的形式，标记的抗-大麻素抗体，例如，这样的用乳胶颗粒或胶体金(collodial gold)标记的抗体，已经通过侧向流动免疫色谱法(lateral flow immunochromatography)被用于大麻素检测。使用的药物衍生物一般基于母体分子Δ-9-四氢大麻酚(THC)和它的主要代谢物THC-COOH。对于THC修饰，通常将交联的试剂在C2、C5’或苯酚基C1位置连接到所述化合物(例如，见专利GB1364925、EP0276732、EP0279308、US5237057、US5747352和NatureNew Biology(1972)236卷216-217页)。也可以用与THC同样方式将THC-COOH衍生化。另外，在THC-COOH的C9的羧基的可用性使其可以利用碳二亚胺交联反应直接交联到载体分子的氨基。预期针对通过C1、C2和C5’偶联的THC或THC-COOH产生的抗体对于这两种化合物显示不同的交叉反应性，原因分别在于C9的羧基是不存在和存在的。因此，为了实现THC和THC-COOH可比较的交叉反应性，许多已知的用于这些化合物检测的免疫测定法采用针对通过羧基在C9偶联到载体分子的THC-COOH产生的抗体。许多用于THC的免疫测定是可商购的。Roche Diagnostics放射性免疫测定(美国专利号4438207)和荧光极化免疫测定(欧洲专利号0392332)使用针对通过苯酚基在C1偶联到载体蛋白的THC-COOH和类似放射性标记的或荧光标记的THC-COOH产生的抗体。正如所料，这个测定显示优异的所述酸的检测而与母体药物THC只有5％的交叉反应性。Abbott荧光极化免疫测定法(欧洲专利号0279308)使用针对通过羧酸酯基在C9连接到载体蛋白质的THC-COOH和在同样位置具有荧光部分的THC-COOH而产生的抗体。这个测定法显示了和母体药物以及11-羟基衍生物(图1，化合物III)更佳的交叉反应性。许多用于大麻素检测的酶免疫测定也是可商购的，其包括由Cozart Bioscience Limited制造提供的一种。这些采用针对通过羧基酯基连接到载体蛋白质的THC-COOH而产生的抗体和辣根过氧化物酶(HRP)-标记的THC-COOH(通过所述酸的羧酸酯基连接的标记)。几乎全部所述的免疫测定法适于检测THC-COOH，使它们适合于利用基质(matrice)例如尿和血液检测大麻的使用。然而，来自大麻使用者的口腔流体(唾液)不显示或显示微量的THC-COOH和THC-OH。因而，主要的影响精神活动组分THC的测定在利用口腔流体样品(推荐作为路边测试滥用药物的最佳基质)路边测试在此药物影响下的驾驶的情况下是必要的。检测少量的母体药物THC的能力也是必需的以能够发现这个药物的最近使用。本专利技术通过提供新的竞争性免疫测定技术用于THC检测解决了该问题，所述竞争性免疫测定技术也可以提供对THC-COOH和THC-OH两者都表现高交叉反应性的优点。专利技术概述已经发现通过使用THC生物合成中的中间体的载体缀合物，更具体而言是通过其羟基缀合到大分子载体例如牛血清白蛋白的5-戊基间苯二酚(见图2)，即使在非常低水平如可以在口腔流体样品中发现的例如≤20ng/ml的THC也可以被竞争性免疫测定法检测。出乎意料地，发现自由溶液中的5-戊基间苯二酚不干扰可商购的抗-THC抗体(从East CoastBiologics，USA得到的小鼠单克隆抗-THC抗体)对固定化的5-戊基间苯二酚-大分子缀合物的结合。而且，可以利用这样一种缀合物和抗体组合以对所述母体药物可比较的灵敏度检测THC-OH，而可以以低到约1.0ng/ml的远远更高的灵敏度检测THC-COOH。因此，本专利技术在一个方面提供了在液体样品中检测THC的方法，该方法包含(a)将所述样品与(i)5-戊基间苯二酚/大分子载体缀合物，其中5-戊基间苯二酚是通过它的苯环上的羟基或其衍生物缀合到所述载体，和(ii)能够结合THC和所述缀合物两者的抗-THC抗体相接触；和(b)测定所述抗体与所述缀合物的结合是否在所述样品的存在下减少。理想地，所述抗-THC的抗体将另外同时结合THC-COOH和THC-OH，例如将采用针对通过羧酸酯基连接到载体蛋白质的THC-COOH而产生的抗体，举例说明是上面提到的商业的抗-THC抗体。那么所述抗体对本专利技术中缀合物结合的减少将用来指示所述样品含有一种或多种等于或大于最小检测限的THC、THC-COOH和THC-OH。本专利技术的测定方法可以符合任何常规的竞争性免疫测定的形式。例如，它可以采用常规的竞争性ELISA的形式，其中将所述抗体或5-戊基间苯二酚/载体缀合物固定在固体载体上。然而，对于现场测试例如路边测试最便利是，本专利技术的方法采用多孔测试条的侧向流动免疫色谱测定的形式。还在这个情况下，用于分析物检测的固定化试剂可以是固定化的抗体或固定化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测液体样品中△－９－四氢大麻酚（ＴＨＣ）的方法，该方法包含： （ａ）将所述样品与（ｉ）５－戊基间苯二酚／大分子载体缀合物和（ｉｉ）能够结合ＴＨＣ和所述缀合物两者的抗体接触，其中在所述５－戊基间苯二酚／大分子载体缀合物中５－戊基间苯二酚是通过它的苯环上的羟基或其衍生物缀合到所述载体；和 （ｂ）测定所述抗体与所述缀合物的结合是否在所述样品的存在下减少。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：AMT杰汉里，CW汉德，
申请(专利权)人：考扎特生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]
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