本发明专利技术提供了一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素－２１构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ｓｅｒ?Ｓｅｒ?Ｇｌｙ?Ｇｌｙ?Ｓｅｒ?Ｇｌｙ?Ｇｌｙ?Ｇｌｙ?Ｇｌｙ?Ｓｅｒ?Ｇｌｙ?Ｇｌｙ?Ｇｌｙ?Ｇｌｙ?Ｓｅｒ。本发明专利技术融合蛋白同时具有链亲和素和白细胞介素－２１的活性，可通过链亲和素与生物素的强力结合将白细胞介素－２１锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在γ射线灭活肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素－２１的活性。经本发明专利技术融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备预防和治疗肿瘤的疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及来源于动物的多肽，特别是白 细胞介素-21。
技术介绍
白细胞介素-21(Interleukin-21，IL-21)是一种T细胞生长因子，有很重要的免 疫调节作用。IL-21主要由活化的T细胞产生，与IL-2、IL-4和IL-15具有高度同源性，其 功能主要有在抗CD3抗体协同下促进T细胞增殖；在抗CD40抗体协同下促进B细胞增殖； 并促进NK细胞的增殖、分化和成熟并表达CD16分子；增强NK细胞介导的细胞毒活性和免 疫监视功能。特别是IL21促进T细胞和NK细胞分泌IFN- γ而增强抗肿瘤效应，能够抑制 肿瘤的生长和转移，这在肿瘤的临床免疫治疗中具有潜在的应用前景。目前临床上主要是 通过增强肿瘤抗原的免疫原性来制备肿瘤细胞疫苗，通过原位基因转染(或转导)在肿瘤 病灶局部实现细胞因子等持续有效表达的治疗策略。但是，用基因修饰法制备肿瘤细胞疫 苗存在如下固有缺陷修饰效率一般都较低(尤其是原位基因转染或转导)，并取决于肿瘤 细胞类型；因影响因素较多，致使治疗基因的蛋白质表达产物的有效浓度在局部难于达到 并较长时间地维持，从而实际抗肿瘤的临床效果非常有限；因个体差异和获得肿瘤标本时 肿瘤细胞的成活状态不一致，往往有些病人因无法提供成活状态较好的肿瘤细胞，最终不 能制成自体肿瘤细胞疫苗；往往有潜在的病毒载体安全性问题(所谓“遗 传毒性”)和免疫 原性问题(反复使用同一病毒载体会影响导入基因的表达效率)；很难同时高效表达多个 具有协同作用的免疫刺激因子，并对它们的表达量进行精确控制。此外，基因修饰的自体肿 瘤细胞疫苗制备比较费时，不易大规模开展和广泛使用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以对肿瘤细胞进行快速表面修饰并能够 永久地锚定在肿瘤细胞表面的新型白细胞介素-21。本专利技术解决上述技术问题的技术方案是一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素-21构成，其中 所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser0本专利技术融合蛋白中的链亲和素位于接头肽的N端或C端；其中链亲和素位于接头 肽的C端的融合蛋白(如SEQ NO. 2)的活性比链亲和素位于接头肽的N端的融合蛋白(如 SEQ NO. 1)高两倍以上。本专利技术融合蛋白可通过将链亲和素基因、白细胞介素-21基因以及连接所述的链 亲和素和白细胞介素-21的接头多核苷酸通过基因重组、转化构建工程菌表达获得，其中 基因重组和转化的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。为了便于融合蛋白的分离纯化，本专利技术所述的融合蛋白的链亲和素部分的末端还可以连接有纯化标签，如本专利技术融合蛋白的SEQ NO. 4链亲和素的C端连有组氨酸标签、本 专利技术融合蛋白SEQ NO. 3的链亲和素的N端连有组氨酸标签。本专利技术还提供一种编码本专利技术融合蛋白的多核苷酸，该多核苷酸由成熟链亲和素 cDNA、成熟白细胞介素-21cDNA 通过 TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGCGGG GGC GGA TCC连接而成；该多核苷酸中成熟链亲和素cDNA的末端还可以连接有CATCAT CAC CAT CAC CAT。将所述的编码本专利技术融合蛋白的多核苷酸通过基因重组插入到原核表达载体中， 然后转化大肠杆菌可获得高效表达本专利技术融合蛋白的工程菌；所述的原核表达载体可以是 pET24a 或 pET24d 或 pET21a，大肠杆菌为 BL21 (DE3)。本专利技术融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在，从包涵体中分离纯化 蛋白并复性处理后，即可获得本专利技术融合蛋白。本专利技术融合蛋白采用富含甘氨酸和丝氨酸的链接肽连接白细胞介素-21和链亲 和素，此15肽非常灵活，有助于融合蛋白中各单元蛋白质分子的独立折叠，从而保存各自 的生物活性，使融合蛋白具有链亲和素和白细胞介素-21的双重活性，可通过链亲和素与 生物素的强力结合将白细胞介素-21锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，且能在Y射线灭活 肿瘤细胞表面稳定存在，并仍保持白细胞介素-21的活性。经本专利技术融合蛋白表面修饰的肿瘤疫苗具有预防和治疗肿瘤的作用，可用于制备 预防性和治疗性肿瘤的疫苗。本专利技术所述的肿瘤疫苗是将本专利技术融合蛋白锚定在生物素化 的肿瘤细胞表面获得的。本专利技术所述的肿瘤疫苗的制备充分利用了蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以 及生物素与链亲和素高效而强有力几乎不可逆的结合这两个特性，先用生物素化试剂将生 物素化学交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后本专利技术融合蛋白借助链亲和素与生物素的特 异结合将白细胞介素-21迅速永久地锚定在肿瘤细胞表面，从而使白细胞介素-21在局部 达到持续有效的治疗浓度；再者，由于一个链亲和素蛋白可结合四个生物素，因此本专利技术融 合蛋白锚定到肿瘤细胞的量是可以精确控制的。附图说明图1是6His-SA-L-IL21-pET24重组质粒的结构图。图2是IL21-L-SA-6His_pET21重组质粒的结构图。图3是融合蛋白6His-SA-L-IL21的SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准，2是 工程菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是包涵体，5是Ni-NTA柱层析后；6是2-Iminobiotin 亲和柱层析后。图4是用抗IL-21单克隆抗体及荧光标记的二抗经流式细胞仪对锚定在生物素化 的B16. FlO表面上本专利技术融合蛋白进行检测的结果，左峰为未修饰的细胞(阴性对照)，而 右峰为本专利技术融合蛋白锚定修饰的细胞。图5是用刀豆蛋白刺激鼠淋巴细胞MTT法对锚定在生物素化的B16. FlO表面上 本专利技术融合蛋白的IL-21进行生物活性测定的结果，以锚定在生物素化的B16. FlO表面上 GFP-L-SA为阴性对照；其中+表示本专利技术融合蛋白，+表示融合蛋白GFP-L-SA。图6是接种本专利技术肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的肿瘤生长情况曲线图，以GFP-L-SA修饰的B6. FlO肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中虚线表示本专利技术融合蛋白组，实线 表示GFP-L-SA对照组。图7是接种本专利技术肿瘤疫苗后的预防肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以 GFP-L-SA修饰的B6. FlO肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中虚线表示本专利技术融合蛋白组，实线 表示GFP-L-SA对照组。图8是接种本专利技术肿瘤疫苗后的治疗肿瘤小鼠模型的小鼠存活情况曲线图，以 GFP-L-SA修饰的B6. FlO肿瘤细胞疫苗为实验对照，其中虚线"“_表示本专利技术融合蛋白组，虚 线____表示GFP-L-SA对照组。下面将通过实施例进一步说明本专利技术以及本专利技术具有的技术效果。 具体实施例方式下述实施例和实验所用的材料及设备如下细胞株、菌株与质粒B16. FlO (鼠黑色素瘤细胞株)；菌株Str印tomyces avidinii (亲和素链霉菌，ATCC)，DH5a 和 BL21 (DE3)；原核表达质粒 pET24a(Kanar, Novagen)。主要生化试剂及材料=DNeasy组织试剂盒和质粒DNA的制备试剂盒(Qiagen)，寡 核苷酸的合成(Sigma)，Trizol, SuperScript 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接一链亲和素和一白细胞介素－２１构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高基民，法萍萍，许晓玲，
申请(专利权)人：温州医学院，
类型：发明
国别省市：33
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