一种圆红冬孢酵母的转化方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种圆红冬孢酵母的转化方法。所述方法包括以下步骤：1)取圆红冬孢酵母单克隆，接种于培养基中培养，收集菌体；2)向步骤1)中的菌体添加转化液，重悬菌体，静置；所述转化液包括PEG、介导质和鲑鱼精DNA；3)向步骤2)中的菌体中添加待转化DNA，进行孵育；4)向步骤3)中的菌液中加入二硫苏糖醇溶液或二甲基亚砜溶液，然后进行热击，将收集菌体，进行重悬，孵育培养。本发明专利技术针对圆红冬孢酵母构建了高效可靠的外源DNA的转化方法，本发明专利技术圆红冬孢酵母的转化方法流程简单并且转化效率高，转化效率最高可达到1938转化子/μg DNA。DNA。DNA。

【技术实现步骤摘要】
一种圆红冬孢酵母的转化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种圆红冬孢酵母的转化方法。

技术介绍

[0002]转化是分子生物学的最常见的实验技术，也是合成生物学的基本手段。外源DNA通过转化在可以在宿主中实现稳定表达目的蛋白的作用，在酵母中常用的转化手段包括醋酸锂转化法，电穿孔转化法和农杆菌侵染等，并且根据酵母种类不同，各种转化方法的效率和具体操作参数差异较大。
[0003]圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)隶属于真菌，双核菌亚界，担子菌门，锁掷酵母目，红冬酵母属。与大肠杆菌相比，圆红冬孢酵母拥有更齐全的基因表达调控机制、加工修饰表达产物和分泌表达产物的能力，并且对环境具有很强的抗逆性和鲁棒性。作为一株典型的产油模式菌株，其油脂积累量可以达到细胞干重的70％以上，此外，圆红冬孢酵母在生产类胡萝卜素、氨基酸衍生物和酶制剂方面具有巨大的工业应用潜力。但是由于圆红冬孢酵母细胞壁过厚，传统的转化方法对其转化效果并不理想。目前圆红冬孢酵母的主流转化方法为农杆菌介导的转化，由赵宗保教授实验室开发并发表于FEMS yeast research杂志(Functional integration of multiple genes into the genome of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides)，但此方法耗时较长且农杆菌与酵母菌之间的细胞连接需要特定的步骤。Tully和Gilbert在1985年开发圆红冬孢酵母原生质体转化(《Transformation of Rhodosporidium toruloides》)，此方法较为繁琐，需要特定的β
‑
1,3
‑
葡聚糖和细胞壁再生的步骤。赵宗保教授团队2017年发表《Fast and efficient genetic transformation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides by using electroporation》提出通过前处理优化电转化效率，但是此方法针对于Rhodosporidium toruloides NP11单倍体转化效率较好，经过本实验室验证并不适用圆红冬孢酵母工程菌。Tsai等人开发了醋酸锂/聚乙二醇介导的化学转化(《Development of a sufficient and effective procedure for transformation of an oleaginous yeast,Rhodosporidium toruloides DMKU3
‑
TK16》)，但其转化效率极低(20个转化子/μg DNA)限制了其在基因操作中的应用。转化效率低和步骤繁琐依旧是限制圆红冬孢酵母基因改造发展的重要问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种圆红冬孢酵母的转化方法。本专利技术提供的圆红冬孢酵母的转化方法流程简单并且转化效率高，与传统醋酸锂转化相比转化效率大幅提高，由20转化子/μg DNA提升至～2000转化子/μg DNA。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0006]本专利技术提供了一种圆红冬孢酵母的转化方法，包括以下步骤：
[0007]1)取圆红冬孢酵母单克隆，接种于培养基中培养，收集菌体；
[0008]2)向步骤1)中的菌体添加转化液，重悬菌体，静置；所述转化液包括PEG、介导质和
鲑鱼精DNA；
[0009]3)向步骤2)中的菌体中添加待转化DNA，进行孵育；
[0010]4)向步骤3)中的菌液中加入二硫苏糖醇溶液或二甲基亚砜溶液，然后进行热击，将收集菌体，进行重悬，孵育培养；
[0011]所述PEG为PEG1000和/或PEG8000；所述介导质为氯化锂或醋酸锂。
[0012]在本专利技术的技术方案中，加入PEG1000和/或PEG8000可以保护圆红冬孢酵母不受高浓度氯化锂或醋酸锂伤害，还可以中和圆红冬孢酵母表面电子，促进待转化DNA与中和圆红冬孢酵母的细胞膜接触更紧密。经过实验证明，当PEG为PEG1000和PEG8000时，可以获得更多的转化子，转化效率最高可达到1938转化子/μg DNA。本专利技术解决了圆红冬孢酵母传统转化方法流程复杂并且转化效率低的问题，本专利技术的技术方案相对于主流使用的农杆菌介导的转化相比流程简单，实验时间短，转化效率大幅提高。
[0013]与加入二甲基亚砜溶液相比，本专利技术的转化方法中加入二硫苏糖醇溶液，可以提高获得的转化子的数量，进而有效提高转化效率。
[0014]作为本专利技术所述圆红冬孢酵母的转化方法的优选实施方式，所述步骤1)中，取圆红冬孢酵母单克隆，接种至YPD培养基中培养，此时菌液的OD
600
<1转接至YPD培养基培养至菌液的OD
600
为0.2，继续培养4
‑
6h。
[0015]在本专利技术的技术方案中，调整了转接后的培养时间，培养4
‑
6h后OD
600
小于1，此时的圆红冬孢酵母状态更适于接收待转化DNA。
[0016]作为本专利技术所述圆红冬孢酵母的转化方法的优选实施方式，当PEG为PEG1000和PEG8000时，PEG1000和PEG8000的质量浓度均为50％。PEG1000和PEG8000的体积比为1：1。
[0017]当PEG为PEG1000和PEG8000的复配时，可以较好的提高圆红冬孢酵母的转化效率，获得的转化子的数量较多。
[0018]作为本专利技术所述圆红冬孢酵母的转化方法的优选实施方式，所述氯化锂或醋酸锂的浓度为100mM
‑
1M。
[0019]作为本专利技术所述圆红冬孢酵母的转化方法的优选实施方式，所述待转化DNA的质量为500ng
‑
1μg。
[0020]本专利技术使用的待转化DNA的量更少，500μL混合体系中只需要500ng待转化DNA，成本较低。
[0021]作为本专利技术所述圆红冬孢酵母的转化方法的优选实施方式，所述二硫苏糖醇溶液的浓度为1M，所述DMSO溶液的浓度为10％。
[0022]作为本专利技术所述圆红冬孢酵母的转化方法的优选实施方式，所述步骤4)中，热击的温度为40
‑
42℃，热击的时间为30
‑
60min；优选地，热击的温度为40℃，热击的时间为30min。
[0023]Tsai和Peter Otoupal所用的37℃热击条件对于圆红冬孢酵母工程菌来说转化效果有限，当热击的温度为37℃，热击的时间为60min，没有长出转化子。本专利技术改变热击的温度和时间，可以较好的提高圆红冬孢酵母的转化效果。
[0024]作为本专利技术所述圆红冬孢酵母的转化方法的优选实施方式，所述步骤4)中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种圆红冬孢酵母的转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取圆红冬孢酵母单克隆，接种于培养基中培养，收集菌体；2)向步骤1)中的菌体添加转化液，重悬菌体，静置；所述转化液包括PEG、介导质和鲑鱼精DNA；3)向步骤2)中的菌体中添加待转化DNA，进行孵育；4)向步骤3)中的菌液中加入二硫苏糖醇溶液或二甲基亚砜溶液，然后进行热击，将收集菌体，进行重悬，孵育培养；所述PEG为PEG1000和/或PEG8000；所述介导质为氯化锂或醋酸锂。2.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，所述步骤1)中，取圆红冬孢酵母单克隆，接种至YPD培养基中培养，此时菌液的OD
600
<1，转接至YPD培养基培养至菌液的OD
600
为0.2，继续培养4
‑
6h。3.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，当PEG为PE...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥松，徐嫣艺，吴金勇，袁丽霞，姚建铭，
申请(专利权)人：合肥中科健康生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：