【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和发酵工程，具体涉及一种产四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、四氢嘧啶的合成主要有两种方法：化学合成法和生物合成法。化学合成法存在着很多问题，包括生产过程复杂、合成产率低、副产物多且与目标产物的化学性质相似、下游分离纯化难度很高等。生物合成法主要采用酶催化法和发酵法，在生物发酵法中，首先需要在菌体中构建四氢嘧啶的生物代谢通路，通过天冬氨酸的代谢支路途径，四氢嘧啶的合成过程可由三步完成，首先天冬氨酸激酶(lysc)催化天冬氨酸生成β-天冬氨酰磷酸；随后在天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)催化下生成天冬氨酸-β-半醛；最后在ectabc编码的3种酶的催化作用下完成四氢嘧啶的合成。
2、在现有研究中，通常通过加强目标产物路径强度，构建四氢嘧啶在大肠杆菌中的代谢通路，同时敲除支路副产物路径来保证目标产物的碳流，这种做法在设计层面是合理的，但对于菌体生长来说可能存在负面影响，很有可能支路途径产物对菌体生长有利，一旦敲除后会影响菌体生长。在四氢嘧啶的生产菌株中，由于支路副产物赖氨酸和高丝氨酸的存在，减少了到四氢嘧啶的碳流量，根据以往研究的经历，敲除二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa以及高丝氨酸脱氢酶基因metl对产量提高有所帮助，但对菌体生长不利，关键支路途径缺失导致氨基酸缺陷型，一定程度上会抑制菌体生长，给菌体造成一定的压力，进而影响四氢嘧啶的生产。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足而提供一种产四氢嘧啶的基因工程菌，以实现菌
2、为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：
3、第一方面，本专利技术提供了一种产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌用生长依赖型启动子分别调控二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa和/或高丝氨酸脱氢酶基因metl的表达；所述大肠杆菌工程菌过表达重组基因，所述重组基因包括基因簇ectabc。
4、本专利技术利用合成生物学技术和基因工程的手段，以大肠杆菌做为出发菌株，表达伸长盐单胞菌来源四氢嘧啶合成途径相关基因簇ectabc，实现四氢嘧啶的异源合成；同时替换竞争路径代谢二氨基庚二酸脱羧酶lysa和高丝氨酸脱氢酶metl的启动子，使菌体生长状态更加合理，从而有效提高四氢嘧啶的产量。
5、优选地，所述生长依赖型启动子包括flia、flic、flgc启动子中的至少一种；所述flia启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示，flic启动子的核苷酸序列如seq id no：2所示，flgc启动子的核苷酸序列如seq id no：3所示。
6、优选地，所述生长依赖型启动子包括flic、flgc启动子中的至少一种。
7、本专利技术利用生长依赖型启动子替换二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa和高丝氨酸脱氢酶基因metl的原有启动子，从而调控竞争支路中高丝氨酸和赖氨酸的生产，以实现在菌体生长阶段不影响关键氨基酸的生产，满足菌体生长，同时在菌体稳定期减少氨基酸的表达量，将碳流量集中到四氢嘧啶的表达路径上来，以此达到高产四氢嘧啶的目的。经实验探究发现，flia、flic、flgc启动子分别调控lysa和metl表达时能有效提升工程菌株的四氢嘧啶产量，当采用flic或flgc启动子调控时，四氢嘧啶的产量提升效果最显著。
8、优选地，所述重组基因还包括天冬氨酸激酶基因lysc和天冬氨酸氨裂解酶基因aspa。
9、本专利技术在过表达基因簇ectabc的基础上，还通过组合表达谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸激酶基因lysc以及大肠杆菌来源的天冬氨酸氨裂解酶基因aspa来进一步提高四氢嘧啶的产量。
10、优选地，所述重组基因的表达载体为prsfduet-1。
11、优选地，所述替换生长依赖型启动子分别调控二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa和高丝氨酸脱氢酶基因metl的表达的具体过程为：将大肠杆菌来源的二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa和/或大肠杆菌来源的高丝氨酸脱氢酶基因metl整合到petduet-1表达载体的mcs i区和/或mcs ii区上，通过同源重组将生长型启动子替换基因整合区域的t7启动子。
12、专利技术人在实验探究过程中发现，直接敲除大肠杆菌中二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa以及高丝氨酸脱氢酶基因metl，会出现关键支路途径缺失从而导致氨基酸缺陷型的问题，一定程度上会抑制菌体生长，进而影响四氢嘧啶的生产。因此，专利技术人通过替换竞争路径代谢酶lysa和metl的启动子，通过生长依赖型启动子对lysa和metl进行调控，能使得菌体生长状态更加合理，从而有效提高四氢嘧啶的产量。
13、优选地，所述大肠杆菌工程菌的出发菌株为大肠杆菌bl21(de3)，所述大肠杆菌bl21(de3)的基因型为e.coli bl21(de3)δlysaδmetl。
14、本专利技术对直接敲除了竞争支路的关键代谢酶基因lysa和metl的菌株进行产四氢嘧啶发现，这种做法在设计层面是合理的，但是对于菌体生长来说存在负面影响，支路途径的产物对菌体生长有利，一旦敲除后会影响菌体生长；因此，本专利技术以e.coli bl21(de3)δlysaδmetl作为出发菌株，对lysa和metl缺失基因进行回补，并替换lysa和metl的原有启动子进行调控从而获得高产四氢嘧啶工程菌株。
15、第二方面，本专利技术还提供了上述产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：
16、(1)将重组基因整合到表达载体上，构建重组表达载体ⅰ；
17、(2)将大肠杆菌来源的二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa和/或大肠杆菌来源的高丝氨酸脱氢酶基因metl整合到petduet-1表达载体的mcs i区和/或mcs ii区上，通过同源重组将生长型启动子替换基因整合区域的t7启动子，构建重组表达载体ⅱ；
18、(3)将上述重组表达载体ⅰ和ⅱ转入到步骤大肠杆菌出发菌株中，得到所述大肠杆菌工程菌。
19、第三方面，本专利技术还提供了上述大肠杆菌工程菌在生产四氢嘧啶中的应用。
20、优选地，所述生产包括以下步骤：
21、(1)种子培养：将所述大肠杆菌工程菌活化，挑取单菌落接种至种子培养基中，35-39℃，200-240rpm培养5-7h；
22、(2)发酵培养：以20％的接种量将种子培养物接入分批发酵培养基中，加入1ml微量元素，35-39℃条件下培养5-7h，添加0.2mmol/l的iptg 150ml于35-39℃诱导培养，即得；
23、所述分批发酵培养基成分为：na2hpo4·12h2o 17.9g/l、kh2po4 3.1g/l，nh4cl2.0g/l、(nh4)2hpo4 1.0g/l、二水合柠檬酸三钠2.2g/l、酵母提取物2.0g/l、甘油30g/l、胰蛋白胨15g/l，调节ph为7.0；
24、所述微量元素成分为：柠檬酸铁铵5.6g/l、七水本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌用生长依赖型启动子分别调控二氨基庚二酸脱羧酶基因lysA和/或高丝氨酸脱氢酶基因metL的表达；所述大肠杆菌工程菌过表达重组基因，所述重组基因包括基因簇ectABC。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述生长依赖型启动子包括fliA、fliC、flgC启动子中的至少一种；所述fliA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，fliC启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，flgC启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述生长依赖型启动子包括fliC、flgC启动子中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组基因还包括天冬氨酸激酶基因lysC和天冬氨酸氨裂解酶基因aspA。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组基因的表达载体为pRSFDuet-1。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述替
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，所述大肠杆菌BL21(DE3)的基因型为E.coli BL21(DE3)ΔlysAΔmetL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.权利要求1-7任一项所述的大肠杆菌工程菌在生产四氢嘧啶中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生产包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种产四氢嘧啶的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌用生长依赖型启动子分别调控二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa和/或高丝氨酸脱氢酶基因metl的表达；所述大肠杆菌工程菌过表达重组基因，所述重组基因包括基因簇ectabc。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述生长依赖型启动子包括flia、flic、flgc启动子中的至少一种；所述flia启动子的核苷酸序列如seq id no：1所示，flic启动子的核苷酸序列如seq id no：2所示，flgc启动子的核苷酸序列如seq id no：3所示。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述生长依赖型启动子包括flic、flgc启动子中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组基因还包括天冬氨酸激酶基因lysc和天冬氨酸氨裂解酶基因aspa。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组基因的表达载体为pr...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥松，雷正，吴金勇，袁丽霞，姚建铭，
申请(专利权)人：合肥中科健康生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。