【技术实现步骤摘要】
本申请涉及微生物基因工程，尤其是涉及一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)是人乳寡糖中重要的成分之一，具有增强人体免疫力，调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(efsa)、欧盟(eu)和美国食品药品管理局(fda)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前，lnnt的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法，其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料，且以较低的环境代价获得高经济产出，因此具有更为广阔的应用前景。
2、目前在微生物内lnnt的合成前体包括胞内自身合成的核苷酸udp-glcnac、udp-gal以及外源添加的乳糖。其合成过程是，首先胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶lacy转运至胞内，然后和胞内udp-glcnac在异源表达的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶lgta催化下生成lnt ii。lnt ii和udp-gal继续被异源表达的β-1,4-半乳糖基转移酶lgtb催化生成lnnt。但目前lnnt的微生物合成产量仍然较低，无法满足大批量工业生产的需求。根据前期研究发现，质粒型菌株合成lnnt会出现质粒丢失现象，无法稳定高效合成lnnt，且lnnt合成的限速因素没有确定，另外，lntⅱ的过多残留会影响lnnt的产物纯化，获得的lnnt产量还较低。
技术实现思路
1、本申请的目的在
2、为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
3、第一方面，本申请提供了一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过表达重组基因，所述重组基因包括β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶lgta、udp-葡萄糖-4-差向异构酶gale和β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt；
4、所述重组大肠杆菌中基因pgm、galu、gale、glms、glmm、glmu中的启动子至少一种为强启动子t7。
5、在一些实施例中，β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶lgta来源于neisseriameningitidis mc58。udp-葡萄糖-4-差向异构酶gale来自大肠杆菌k12 mg1655。β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt来自helicobacter pylori。
6、本申请在大肠杆菌的基因组中整合表达了β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶lgta、udp-葡萄糖-4-差向异构酶gale和β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt，构成的重组大肠杆菌可以合成lnnt，lnnt产量较高。
7、本申请优化lnnt合成的限速酶等发酵优化条件来高产lnnt的同时平衡lntⅱ的生成，提高了lntⅱ的胞内利用率，减少了lntⅱ过多残留，避免了资源浪费。
8、作为本申请所述整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述重组大肠杆菌敲除β-半乳糖苷酶基因lacz、udp葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因usha、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsa和可拉酸代谢基因wcac。
9、作为本申请所述整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述重组大肠杆菌的基因组在galm位点整合有galetkm基因簇；所述重组大肠杆菌的基因组在nagb位点整合有β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt基因。
10、作为本申请所述整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt基因的插入位点包括yjiv、xylb、ydeu、intq、caib、wzxc、ybbd和nupg中的至少一个。
11、本申请在yjiv、xylb、ydeu、intq、caib、wzxc、ybbd和nupg等不同位点整合表达β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt基因，获得多拷贝数的产lnnt重组大肠杆菌菌株，进一步提高了lnnt的产量。
12、作为本申请所述整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt含有2～6个拷贝数，优选地，所述β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt含有3个拷贝数。
13、所述重组大肠杆菌的基因组中β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt含有多个拷贝数，可以更好地提高了lnnt的产量，其中β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt的拷贝数为3个时，提升lnnt产量最佳。
14、作为本申请所述整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述重组大肠杆菌的基因组在hlye位点整合有外源转运蛋白。
15、在重组大肠杆菌的基因组中插入表达lnnt从胞内到胞外的转运蛋白后，再次进行lnnt合成路径中的限速酶进行筛选工作，成功鉴定出限速酶并进行组合优化，进一步加强了lnnt合成，同时平衡lntⅱ的生成。
16、作为本申请所述整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌的优选实施方式，所述重组大肠杆菌的基因组在yjgx或ybeq位点整合有lgta基因。
17、第二方面，本申请提供了上述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
18、s1、构建所述重组基因的重组表达载体；
19、s2、采用crisper方法敲除所述β-半乳糖苷酶基因lacz、udp葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因usha、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsa和可拉酸代谢基因wcac，得基因敲除大肠杆菌；
20、s3、将所述重组表达载体转化所述基因敲除大肠杆菌，得所述重组大肠杆菌。
21、第三方面，本申请提供了上述重组大肠杆菌在生产乳糖-n-三糖和乳糖-n-新四糖中的应用。
22、本申请的重组大肠杆菌生产乳糖-n-三糖的含量较少，且生产乳糖-n-新四糖的含量较高。
23、与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
24、本申请提供了一种无质粒的整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌，本申请通过β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt的拷贝数进一步提升了lnnt产量；将lnnt排除到胞外后成功鉴定了lnnt合成的限速酶并进行组合优化从而提高lnnt产量；本申请构建的重组大肠杆菌在5l罐最高lnnt产量90.45g/l，效果十分显著，具有较高的应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种整合表达低产乳糖-N-三糖且高产乳糖-N-新四糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌过表达重组基因，所述重组基因包括β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶LgtA、UDP-葡萄糖4差向异构酶GalE和β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT；
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ、UDP葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因ushA、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaJ、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsA和可拉酸代谢基因wcaC。
3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的基因组在galM位点整合有galETKM基因簇；所述重组大肠杆菌的基因组在nagB位点整合有β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT基因。
4.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT基因的插入位点包括yjiV、xylB、ydeU、intQ、caiB、wzxC、ybbD和nupG中的至少一
5.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有2～6个拷贝数。
6.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有3个拷贝数。
7.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的基因组在hlyE位点整合有外源转运蛋白。
8.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的基因组在yjgX或ybeQ位点整合有lgtA基因。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.如权利要求1～8任一项所述的重组大肠杆菌在生产乳糖-N-三糖和乳糖-N-新四糖中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种整合表达低产乳糖-n-三糖且高产乳糖-n-新四糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌过表达重组基因，所述重组基因包括β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶lgta、udp-葡萄糖4差向异构酶gale和β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt；
2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除β-半乳糖苷酶基因lacz、udp葡萄糖6-脱氢酶基因ugd、核苷二磷酸糖焦磷酸酶基因usha、葡萄糖-1-磷酸酶基因agp、磷酸十一碳基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj、海藻糖-6-磷酸合成酶基因otsa和可拉酸代谢基因wcac。
3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的基因组在galm位点整合有galetkm基因簇；所述重组大肠杆菌的基因组在nagb位点整合有β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt基因。
4.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：廖迎雪，陈祥松，吴金勇，袁丽霞，姚建铭，
申请(专利权)人：合肥中科健康生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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