一种提高突变基因检测灵敏度的方法及其应用技术

本申请提出了一种提高突变基因检测灵敏度的方法及其应用，涉及突变基因检测技术领域。该方法包括以下步骤：采集样本，提取DNA；选用末端添加碱基A的Taq酶扩增DNA序列，得到扩增后的PCR产物；构建细菌质粒，该质粒中含有CRISPR和氨苄抗生素基因表达框，细菌质粒含有两个相邻的XcmI酶切位点，通过XcmI酶切制备T载体；利用快速连接酶将扩增后的PCR产物克隆到上述细菌质粒中得到连接产物；将连接产物转染到细菌感受态细胞中，经过孵育得到菌液，随后将菌液涂布在含有氨苄抗生素的培养基中培养得到耐药菌落；挑取耐药菌落进行基因序列验证。本申请提供的方法灵敏性高，还能够应用到肿瘤突变基因检测。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及突变基因检测，具体而言，涉及一种提高突变基因检测灵敏度的方法及其应用。

技术介绍

1、基因突变检测可用于多种疾病的早期筛查、诊断及预后判断。多种恶性肿瘤，如恶性黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、肺癌等存在不同比例的b-raf基因突变；结直肠癌、胰腺癌、肺癌等存在不同比例的k-ras基因突变。良性肿瘤的患者若是检出b-raf或k-ras基因突变，提示有肿瘤恶变的可能。pik3ca基因突变检测，对肺癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤患者的早期筛查、诊断及预后具有重要意义。

2、目前突变基因检测主要通过高通量测序和荧光pcr的方法进行检测，由于肿瘤高度异质性，肿瘤基因样本中存在大量的正常序列，现有的检测方法难以检测到极低丰度的突变基因。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种提高突变基因检测灵敏度的方法，此方法能检测极低丰度的突变基因，提升突变基因检测的灵敏度。

2、本申请的另一目的在于提供一种提高突变基因检测灵敏度的方法在肿瘤突变基因检测中的应用，提高肿瘤突变基因检测的灵敏度。

<本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述S2中扩增的反应体系包括2×Taq酶50μL、10μM正向引物2μL、10μM反向引物2μL、DNA模板5μL和水41μL。

3.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述S4中克隆时采用的反应体系中包括10×T4 DNABuffer 10μL、DNA载体10μL、PCR纯化产物10μL、ddH2O60μL和T4 DNA酶10μL。

4.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征...

【技术特征摘要】

1.一种提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s2中扩增的反应体系包括2×taq酶50μl、10μm正向引物2μl、10μm反向引物2μl、dna模板5μl和水41μl。

3.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s4中克隆时采用的反应体系中包括10×t4 dnabuffer 10μl、dna载体10μl、pcr纯化产物10μl、ddh2o60μl和t4 dna酶10μl。

4.根据权利要求1所述的提高突变基因检测灵敏度的方法，其特征在于，所述s5中的培养基为lb...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊亚明，刘志鹏，陈奕豪，李佩贤，罗微，
申请(专利权)人：佛山市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：