【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种基于crispr/cas12a的碳青霉烯抗性基因blandm检测方法。
技术介绍
1、碳青霉烯具有强大的广谱杀菌活性，是临床上用于多重耐药菌或超级致病细菌的“最后一道防线”类抗生素。碳青霉烯类抗生素(包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南等)通常比普通β-内酰胺类抗生素更加稳定，容易在土、水环境中残留。研究表明，在医院废水、城市污水等生境中，碳青霉烯的残留浓度可达ng/l-mg/l级别。碳青霉烯在环境中的积累促使相应的抗性基因产生、持留或传播，带来不可忽视的环境和健康风险。碳青霉烯抗性基因blandm能够编码碳青霉烯水解酶，使碳青霉烯类抗生素失活。它是导致临床和环境中菌株产生碳青霉烯抗性的关键基因，也是最常检测到的碳青霉烯抗性基因之一。一项覆盖14个省份、25家三级医院的回顾性研究显示，大肠杆菌(escherichia coli)中最常见的碳青霉烯抗性基因是blandm(74.4％)。
2、目前已有报道的抗生素抗性基因检测手段主要包括等温扩增技术、pcr类技术、测序技术。等温扩增技术类中最具代表性的是环介导等温扩增(lamp)和滚环扩增(rca)，但这些方法尚未得到普及和广泛应用。相比之下，pcr类靶向定量方法和测序类非靶筛查方法更为成熟。尽管pcr类技术检测精准敏感，但其反应条件严格，需要依赖昂贵的热循环仪器以及配套器材。此外，pcr检测时间成本较高。测序技术能够识别所有已知的抗生素抗性基因，并进行非靶标筛查。高精度的一代测序经济成本低，二代测序实现了高通量检测，三代测序减少了二
3、crispr/cas是一种存在于原核生物中的免疫系统。crispr是一段重复和间隔排列的dna片段，可以在胞内识别和存储外源基因片段，用于抵御入侵。cas则是与crispr序列相关的蛋白，具有核酸酶活性。cas蛋白可以通过结合crispr rna(crrna)，在其导引下识别并切割与之相匹配的核酸序列。在多种cas蛋白中，具备反式切割活性的cas12a蛋白(cpf1)具有核酸检测的潜力。
4、因此，亟需开发一种利用crispr/cas12a反应检测碳青霉烯抗性基因blandm的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决现有技术中的不足，具体提供一种基于crispr/cas12a的碳青霉烯抗性基因blandm检测方法，该方法具有特异、快速、仪器依赖性低的特点。
2、本专利技术所采用的具体技术方案如下：
3、本专利技术提供一种基于crispr/cas12a的碳青霉烯抗性基因blandm检测方法，其特征在于，具体方法如下：
4、s1：采集待测样本，并提取待测样本的总dna；
5、s2：以待测样本的总dna中的碳青霉烯抗性基因blandm序列为模板，利用核苷酸序列如seq id no.1所示的引导rna、核苷酸序列如seq id no.2所示的单链荧光探针和cas12a蛋白进行crispr/cas12a反应；所述单链荧光探针5’端标记有荧光报告基团6-fam，3’端标记有荧光淬灭基团bhq-1；
6、s3：所述crispr/cas12a反应在37±0.5℃恒温条件下进行，设置荧光测量参数，获取不同时间点的荧光信号值组成的荧光曲线；选取该荧光曲线线性区域的斜率用于定性判定或定量计算blandm浓度。
7、作为优选，若荧光曲线线性区域的斜率高于检测限，则判定为碳青霉烯抗性基因blandm阳性，否则则判定为碳青霉烯抗性基因blandm阴性。
8、作为优选，将荧光曲线线性区域的斜率带入碳青霉烯抗性基因blandm浓度的标准曲线，定量计算待测样本中碳青霉烯抗性基因blandm的基因浓度。
9、作为优选，荧光测量参数为：激发光波长485nm，带宽20nm，发射光波长535nm，带宽25nm。
10、作为优选，crispr/cas12a反应时长为30分钟，2分钟读取一次荧光信号值。
11、作为优选，crispr/cas12a反应体系中cas12a蛋白浓度为12～50nm，引导rna浓度为10～50nm，单链荧光探针的浓度为40nm；加入的总dna样品与反应体系体积比为1：25；加入的10×反应缓冲液与反应体系体积比为1：10。
12、进一步的，crispr/cas12a反应体系中cas12a蛋白浓度为30nm，引导rna浓度为30nm，单链荧光探针的浓度为40nm，加入的总dna样品体积为2μl，加入的10×反应缓冲液体积为5μl，并加入双重去离子水至50μl。
13、本专利技术相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
14、(1)本专利技术提供的方法能够特异性检测碳青霉烯抗性基因blandm。引导rna与非靶标基因或区域无非特异性结合。单链荧光探针与靶标基因及其他天然非靶标序列均无结合，保证在反应体系中是游离状态。利用设计的引导rna和cas12a蛋白分别识别靶标序列和pam序列，保证双重特异性。
15、(2)本专利技术提供的方法能够快速检测碳青霉烯抗性基因blandm。传统的荧光定量pcr使用热循环靶标序列扩增反应，耗时2小时；而本专利技术基于crispr/cas12a反应，使用恒温靶标序列识别反应，耗时30分钟。与传统方法相比，本专利技术将检测时间缩短75％，快速便捷。
16、(3)本专利技术提供的方法检测碳青霉烯抗性基因blandm对仪器的依赖性小。本专利技术基于crispr/cas12a反应，只需要仪器提供低温发热和温度监控能力，可以使用价格低廉的小型便携式设备，相较荧光定量pcr检测方法对仪器的依赖性更低。
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1.一种基于CRISPR/Cas12a的碳青霉烯抗性基因blaNDM检测方法，其特征在于，具体方法如下：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，若所述荧光曲线线性区域的斜率高于检测限，则判定为碳青霉烯抗性基因blaNDM阳性，否则则判定为碳青霉烯抗性基因blaNDM阴性。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述荧光曲线线性区域的斜率带入碳青霉烯抗性基因blaNDM浓度的标准曲线，定量计算待测样本中碳青霉烯抗性基因blaNDM的基因浓度。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光测量参数为：激发光波长485nm，带宽20nm，发射光波长535nm，带宽25nm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反应时长为30分钟，2分钟读取一次荧光信号值。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反应体系中Cas12a蛋白浓度为12～50nM，引导RNA浓度为10～50nM，单链荧光探针的浓度为40nM；加入的总DNA样品与
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反应体系中Cas12a蛋白浓度为30nM，引导RNA浓度为30nM，单链荧光探针的浓度为40nM，加入的总DNA样品体积为2μL，加入的10×反应缓冲液体积为5μL，并加入双重去离子水至50μL。
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr/cas12a的碳青霉烯抗性基因blandm检测方法，其特征在于，具体方法如下：
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，若所述荧光曲线线性区域的斜率高于检测限，则判定为碳青霉烯抗性基因blandm阳性，否则则判定为碳青霉烯抗性基因blandm阴性。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述荧光曲线线性区域的斜率带入碳青霉烯抗性基因blandm浓度的标准曲线，定量计算待测样本中碳青霉烯抗性基因blandm的基因浓度。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光测量参数为：激发光波长485nm，带宽20nm，发射光波长535nm，带宽25nm。
5.根据权利要求1所述的检...
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