【技术实现步骤摘要】
本申请涉及发酵工程，尤其是涉及一种促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法。
技术介绍
1、乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)是人乳寡糖中重要的成分之一，具有增强人体免疫力，调节肠道菌群和促进细胞成熟等重要的生物学功能。已被欧洲食品安全局(efsa)、欧盟(eu)和美国食品药品管理局(fda)批准可以作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中。目前，lnnt的商业化生产主要包括化学合成和生物合成两种方法，其中生物合成法仅需以廉价的碳源和细胞内可再生供体为原料，且以较低的环境代价获得高经济产出，因此具有更为广阔的应用前景。
2、在微生物内lnnt和lnt的合成前体包括胞内自身合成的核苷酸udp-glcnac、udp-gal以及外源添加的乳糖。其合成过程是，首先胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶lacy转运至胞内，然后和胞内udp-glcnac在异源表达的β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖转移酶lgta催化下生成lnt ii。lnt ii和udp-gal继续被异源表达的β-1,4-半乳糖基转移酶lgtb/β-1,3-半乳糖基转移酶wbgo催化生成lnnt/lnt。但目前lnnt/lnt产量较低且发酵工艺有待优化以满足大批量工业生产的需求。
技术实现思路
1、本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法。本申请优化了生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的发酵工艺，能够有效的提
2、为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
3、本申请提供了一种促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法，包括以下步骤：
4、s1、以重组大肠杆菌为出发菌株，将重组大肠杆菌接种至含有发酵培养基的发酵罐中进行预发酵；
5、s2、待初始碳源消耗完后，分阶段流加碳源，所述碳源为葡萄糖和甘油，所述葡萄糖和甘油的质量比为(2～8)：(2～8)；
6、所述重组大肠杆菌过表达β-1,3-n-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶lgta、udp-葡萄糖4差向异构酶gale和β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt；
7、或者，所述重组大肠杆菌过表达β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt和β-1,3-半乳糖基转移酶sewbdo。
8、本申请使用上述重组大肠杆菌为出发菌株，在发酵过程中使用分阶段葡萄糖和甘油的混合碳源进行补料，能够有效的提高lnnt的发酵水平、合成效率及碳源转化效率。
9、本申请在发酵过程中使用分阶段葡萄糖和甘油的混合碳源进行补料，通过碳源比例的优化，以及分阶段碳源比例的优化比单纯甘油或者葡萄糖进行补料使得lnnt和lnt产量显著提升，具有较高的应用价值。
10、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，所述阶段为发酵阶段i和发酵阶段ii；
11、生产乳糖-n-新四糖，所述发酵阶段i为0～42h，所述发酵阶段ⅱ为43～78h；
12、生产乳糖-n-四糖，所述发酵阶段i为0～66h，发酵阶段ⅱ为67～136h。
13、本申请针对生产乳糖-n-新四糖(lnnt)或乳糖-n-四糖(lnt)，设定了不同发酵阶段，分阶段采用葡萄糖和甘油的混合碳源进行补料，通过碳源比例的优化，进而提高了lnnt和lnt产量。
14、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，生产乳糖-n-新四糖，所述发酵阶段i中所述葡萄糖和甘油的质量比为(4～6)：(4～6)，所述发酵阶段ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为(2～8)：(2～8)。
15、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，生产乳糖-n-四糖，所述发酵阶段i中所述葡萄糖和甘油的质量比为(4～6)：(4～6)，所述发酵阶段ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为(2～8)：(2～8)。
16、本申请使用分阶段并且搭配特殊质量比的葡萄糖和甘油进行发酵补料，进而更好地提高乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的产量，应用价值较高。
17、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，生产乳糖-n-新四糖，所述发酵阶段i中所述葡萄糖和甘油的质量比为6：4，所述发酵阶段ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为4：6。
18、本申请在发酵阶段i使用6葡萄糖：4甘油比例的碳源，在发酵阶段ⅰⅰ使用4葡萄糖：6甘油比例的碳源，获得最高lnnt产量为39.48g/l，比单一使用4葡萄糖：6甘油的混合碳源高出22.88％，比纯甘油碳源高出70.83％。通过碳源比例的优化，以及分阶段碳源比例的优化，大大的提高了lnnt的生产水平。
19、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，生产乳糖-n-四糖，所述发酵阶段i中所述葡萄糖和甘油的质量比为6：4，所述发酵阶段ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为8：2。
20、本申请在发酵阶段i使用6葡萄糖：4甘油比例的碳源，发酵阶段ii使用8葡萄糖：2甘油比例的碳源，获得最高lnt产量为96.48g/l，比单一使用6葡萄糖：4甘油的混合碳源高出23.47％，比纯甘油碳源高出60.19％。通过碳源比例的优化，以及分阶段碳源比例的优化，大大的提高了lnt的生产水平。
21、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，所述β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt含有2～6个拷贝数。
22、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，所述β-1,4-半乳糖基转移酶hpgalt含有3个拷贝数。
23、作为本申请所述促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法的优选实施方式，所述β-1,3-半乳糖基转移酶sewbdo含有2～6个拷贝数。
24、与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
25、本申请提供了一种促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法，本申请在发酵过程中使用分阶段葡萄糖和甘油的混合碳源进行补料，通过碳源比例的优化，以及分阶段碳源比例的优化比单纯甘油或者葡萄糖进行补料使得lnnt和lnt产量显著提升，具有较高的应用价值。
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1.一种促进大肠杆菌发酵生产乳糖-N-新四糖或乳糖-N-四糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段为发酵阶段I和发酵阶段II；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，生产乳糖-N-新四糖，所述发酵阶段I中所述葡萄糖和甘油的质量比为(4～6)：(4～6)，所述发酵阶段Ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为(2～8)：(2～8)。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，生产乳糖-N-四糖，所述发酵阶段I中所述葡萄糖和甘油的质量比为(4～6)：(4～6)，所述发酵阶段Ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为(2～8)：(2～8)。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，生产乳糖-N-新四糖，所述发酵阶段I中所述葡萄糖和甘油的质量比为6：4，所述发酵阶段Ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为4：6。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，生产乳糖-N-四糖，所述发酵阶段I中所述葡萄糖和甘油的质量比为6：4，所述发酵阶段Ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为8：2。
7.如权利要求1所述的方法，其特
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述β-1,4-半乳糖基转移酶HpgalT含有3个拷贝数。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-1,3-半乳糖基转移酶SewbdO含有2～6个拷贝数。
...【技术特征摘要】
1.一种促进大肠杆菌发酵生产乳糖-n-新四糖或乳糖-n-四糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段为发酵阶段i和发酵阶段ii；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，生产乳糖-n-新四糖，所述发酵阶段i中所述葡萄糖和甘油的质量比为(4～6)：(4～6)，所述发酵阶段ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为(2～8)：(2～8)。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，生产乳糖-n-四糖，所述发酵阶段i中所述葡萄糖和甘油的质量比为(4～6)：(4～6)，所述发酵阶段ⅱ中所述葡萄糖和甘油的质量比为(2～8)：(2～8)。
5.如权利要求3所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴金勇，陈祥松，廖迎雪，袁丽霞，姚建铭，
申请(专利权)人：合肥中科健康生物产业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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