核小体转移性载体肽片段及其利用制造技术

本发明专利技术提供高效地将目标外源物质从真核细胞的外部至少向该细胞的细胞质内(进而核小体内)导入的技术。这里公开的将目标外源物质从真核细胞的外部至少向该细胞的细胞质内导入的方法包括：(1)准备外源物质导入用构建体的工序，该外源物质导入用构建体具有由KKRTLRKKKRKKR、KKRTLRKRRRKKR、KKRTLRKRKRKKR和KKRTLRKKRRKKR的任意氨基酸序列构成的载体肽片段、和与该载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧结合的外源物质；(2)将外源物质导入用构建体供给到包含目标真核细胞的试样中的工序；和(3)对供给了外源物质导入用构建体的试样进行孵育，将构建体导入该试样的真核细胞内的工序。序。序。

【技术实现步骤摘要】
核小体转移性载体肽片段及其利用


[0001]本专利技术涉及从真核细胞的外部向该细胞的细胞质内(进而核小体内)导入(转运)外源物质的方法、和该方法所使用的具有载体肽片段的外源物质导入用构建体。

技术介绍

[0002]一直以来，向人或人以外的哺乳动物等的细胞(真核细胞)内导入多肽等外源物质、特别是生理活性物质，使该细胞(进而由该细胞构成的组织或器官)的性状改变或使该细胞的功能得到改善、提高。在该技术的一例中，利用了细胞膜透过性肽(cell penetrating peptide：CPP)。
[0003]例如，专利文献1中公开了包含非专利文献1和非专利文献2中记载的LIM激酶2的作为核小体定位信号(Nucleolar localization signal：以下称为“NoLS”。)已知的序列号5所记载的氨基酸序列(载体肽片段)和目标外源物质的外源物质导入用构建体。该构建体由于包括具有细胞膜透过性的载体肽片段，所以能够将外源物质从真核细胞的外部导入该细胞的细胞质内。
[0004]现有技术文献
[0005]专利文献
[0006]专利文献1：国际公开第2011/013700号
[0007]非专利文献
[0008]非专利文献1：JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，281卷35号，2006年，pp.25223－25230
[0009]非专利文献2：Protein&Peptide Letters，17卷12号，2010年，pp.1480－1488

技术实现思路

[0010]专利技术所要解决的技术问题
[0011]然而，近年来，从医疗等的观点考虑，对以上述NoLS为代表的细胞膜透过性肽的关注提高，希望开发出更有效地将外源物质导入目标细胞的技术。另外，近年来，报道了癌或各种疾病(例如，肌萎缩侧索硬化症(ALS)等)与核小体的异常的关联，对核小体的关注不断高涨。因此，希望开发出新的核小体标志物以及开发出向核小体转运外源物质的手段。
[0012]因此，本专利技术是为了应对这样的期望而作出的，其目的在于提供能够高效地将目标外源物质从真核细胞的外部至少导入该细胞的细胞质内(进而核小体内)的方法。另外，本专利技术的目的在于提供一种构建体，其能够高效地将目标外源物质从真核细胞的外部导入该细胞的内部，该构建体具有载体肽片段和外源物质。
[0013]用于解决技术问题的技术方案
[0014]本专利技术的专利技术人为了提高上述专利文献1所公开的LIM激酶2的NoLS的细胞膜透过性，尝试了在序列号5所示的NoLS的氨基酸序列中各种氨基酸残基的取代。其结果发现，在将序列号5所示的NoLS的氨基酸序列的从N末端侧数第8位的天冬酰胺残基和第9位的天冬
氨酸残基分别取代为碱性氨基酸残基(精氨酸残基或赖氨酸残基)的突变体中，细胞膜透过性提高，进而核小体转移性(定位性)提高。令人惊讶的是，这些取代并不是所谓的保守性取代(例如碱性氨基酸残基取代成其它的碱性氨基酸残基得到的序列)，而是肽的电荷发生变化的取代。即，这里所公开的构建体是通过本专利技术专利技术人的大量的试错而得到从而完成的。
[0015]这里所公开的方法是从真核细胞(特别是不具有细胞壁的以人或人以外的哺乳动物为代表的各种动物细胞)的外部(即细胞膜的外侧)至少向该细胞的细胞质内(进而核小体内)导入(转运)目标外源物质的方法。即，这里所公开的外源物质导入方法包括：
[0016](1)准备外源物质导入用构建体的工序，该外源物质导入用构建体具有：
[0017]由以下的任意氨基酸序列构成的载体肽片段：
[0018]KKRTLRKKKRKKR(序列号1)；
[0019]KKRTLRKRRRKKR(序列号2)；
[0020]KKRTLRKRKRKKR(序列号3)；
[0021]KKRTLRKKRRKKR(序列号4)，和
[0022]与上述载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧结合的上述目标外源物质。
[0023](2)将上述外源物质导入用构建体供给到包含目标真核细胞的试样中的工序；和
[0024](3)对供给了上述外源物质导入用构建体的上述试样进行孵育，将上述构建体导入该试样中的真核细胞内的工序。
[0025]这里，“外源物质”是指能够与上述载体肽片段的N末端侧或C末端侧直接结合或经由适当接头间接结合的无机化合物或有机化合物，且具有能够导入真核细胞内的分子大小和化学性质。
[0026]根据上述构成的外源物质导入方法，通过将目标外源物质(典型地为多肽、核酸、色素、药剂等有机化合物)与上述载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧直接结合或经由适当接头间接结合而构建的外源物质导入用构建体供给到包含作为对象的真核细胞的试样(例如，包含该细胞的培养物)中(即添加到存活的真核细胞中)，能够使该目标外源物质从真核细胞的外部(细胞膜的外侧)穿过细胞膜而高效地导入细胞质内(进而穿过核膜导入核小体内)。
[0027]在这里所公开的外源物质导入方法的优选的一个方式，特征在于，上述外源物质为选自多肽、核酸、色素和药剂中的任意有机化合物。制成包含该种有机化合物的构建体被高效地导入目标的至少细胞质内。
[0028]这里，“多肽”是指具有多个氨基酸通过肽键结合而成的结构的聚合物。多肽的肽键的数量(即，氨基酸残基数)不受限定。即，多肽包含氨基酸残基数为10以上且小于300程度的通常被称为肽的物质和通常被称为蛋白质(典型而言，由300个以上的氨基酸残基构成的高分子化合物)的物质。在该领域中，不严格区分多肽和蛋白质。在本说明书中，将由多个氨基酸残基构成的聚合物(包括寡聚物。)总称为多肽。
[0029]另外，“核酸”是指核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。“核酸”的碱基数不受限定。
[0030]另外，这里所公开的外源物质导入方法的优选的另一个方式中，上述外源物质与上述载体肽片段的C末端侧结合，位于上述载体肽片段的N末端侧的赖氨酸的α－氨基被乙酰化。根据这样的构成，构建体在细胞内的稳定性提高，外源物质能够更稳定地被保持在细胞质内和核小体内。
[0031]另外，这里所公开的外源物质导入方法的另外的一个优选方式中，导入上述外源物质导入用构建体的对象的真核细胞为人或人以外的哺乳动物的细胞。
[0032]根据这里所公开的方法，能够将外源物质高效地导入人或人以外的哺乳动物的细胞的细胞质内、进而导入核小体内。
[0033]另外，为了实现上述目的，通过本专利技术，提供为了将目标外源物质从真核细胞(特别是不具有细胞壁的人或人以外的哺乳动物为代表的各种动物细胞)的外部(即细胞膜的外侧)至少导入(转运到)该细胞的细胞质内(进而核小体内)而人为制作的外源物导入用构建体。
[0034]即，这里所公开的外源物质导入用构建体具有由以下的任意氨基酸序列构成的载体肽片段、和与该载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧结合的上述目标外源物质：
[0035]KKRTL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在体外将目标外源物质从真核细胞的外部至少向该细胞的细胞质内导入的方法，其特征在于，包括：(1)准备外源物质导入用构建体的工序，所述外源物质导入用构建体具有：由以下的任意氨基酸序列构成的载体肽片段：KKRTLRKKKRKKR(序列号1)、KKRTLRKRRRKKR(序列号2)、KKRTLRKRKRKKR(序列号3)、KKRTLRKKRRKKR(序列号4)，和与所述载体肽片段的N末端侧和/或C末端侧结合的所述外源物质；(2)将所述外源物质导入用构建体供给到包含目标真核细胞的试样中的工序；和(3)对供给了所述外源物质导入用构建体的所述试样进行孵育，将所述构建体导入该试样中的真核细胞内的工序。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源物质为选自多肽、核酸、色素和药剂中的任意有机化合物。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述外源物质与所述载体肽片段的C末端侧结合，位于所述载体肽片段的N末端侧的赖氨酸的α－氨基被乙酰化。4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于：导入所述外源物质导入用构建体的对象的真核细胞为人...

【专利技术属性】
技术研发人员：贝利小林菜穗子，吉田彻彦，
申请(专利权)人：东亚合成株式会社，
类型：发明
国别省市：