本发明专利技术公开了激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用。本发明专利技术首次在丝状真菌中构建RNP基因编辑体系，构建的RNP体系可以编辑黑曲霉的基因，该方法免去构建重组载体的繁琐程序，操作简单，可以用于黑曲霉的基因编辑。结合RNP体系进行基因编辑发现，敲除MpkA基因时，黑曲霉菌落较小，生长缓慢，菌丝呈现短杆状，基本无分支。同时，黑曲霉MpkA基因被敲除时，可以促进其蛋白的分泌量。本发明专利技术在丝状真菌的遗传操作以及高通量技术的应用提供了良好的材料以及理论依据，为丝状真菌在工业酶制剂领域的发展提供了研究思路。展提供了研究思路。展提供了研究思路。
【技术实现步骤摘要】
激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用。利用基因调控黑曲霉的菌丝结构呈简单化，以及在黑曲霉总蛋白分泌方面的用途，为丝状真菌的形态调控以及分子遗传学操作领域提供可靠的方法和依据。
技术介绍
[0002]丝状真菌作为一种高效的细胞工厂，被广泛应用于生物制造领域。它可以用来生产工业酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶)、多糖、有机酸、抗生素、生物膜等初级或次级代谢产物。尤其具备表达天然或重组蛋白的能力。例如，黑曲霉(Aspergillus niger)可商业化生产柠檬酸和葡萄糖氧化酶等。丝状真菌被用作高效的细胞工厂，与其独特的形态结构密切相关。
[0003]丝状真菌的主要特征是菌丝结构，例如，典型的丝状真菌黑曲霉的菌丝结构呈管状菌丝形态，即一个菌丝包括长长的杆状主菌丝体、分支菌丝体，分生孢子聚集体。在许多丝状真菌中，个体的菌丝可以与同一个体的其他菌丝融合形成菌丝网络。在深层培养中，宏观形态从分散的菌丝体，到菌丝的簇状聚集体，再到直径几毫米的近球形紧密菌丝颗粒。分散的菌丝可以增加某些酸(富马酸)、蛋白质(淀粉酶、新果糖转移酶、植酸酶)和次生代谢物(青霉素)的产生。然而，颗粒状宏观形态有利于某些分子的产生，包括柠檬酸、糖化酶或聚半乳糖醛酸酶。菌丝生长为底物的定植、水解酶的分泌、营养物质的同化、形态发生的调节和环境信号的识别提供了手段。菌丝的生长和分化是一个复杂的过程，需要控制细胞壁的合成、极化的囊泡运输、胞吞作用、吞噬作用、膨压、细胞器的定位以及细胞质的迁移和融合。此外，丝状真菌与其他多细胞生物有所不同，非同核细胞的丝状真菌，其细胞核可以通过隔膜孔在整个菌丝体网络中自由移动，从而导致丝状真菌具备多核的结构。丝状真菌的特殊结构增加了对其进行遗传改造的难度，一方面遗传物质较难穿过复杂的细胞网络以及细胞壁进入细胞内，另一方面较难获得比较纯的同核突变体。同时，丝状真菌复杂的菌丝结构不利于高通量技术的使用，增加了对其的遗传改造难度。因此，克服丝状真菌的复杂结构导致的遗传操作、高通量筛选的困难，有利于促进我们对丝状真菌的理解和在工业上的应用。综上所述，寻求一种简单的调控丝状真菌菌丝状结的方法对于丝状真菌的研究和应用十分重要。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用。通过本专利技术提供的方法可以调控丝状真菌的菌丝结构呈简单的短杆状，为丝状真菌的遗传操作以及高通量筛提供了材料和依据。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供一株黑曲霉突变株，可以提高菌株分泌总蛋白的能力，可以用于工业发酵领域。
[0006]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0007]激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用，其中，所述的激酶基因为丝状真菌MAPK途径和/或cAMP
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PKA途径上的激酶基因。
[0008]所述的MAPK途径为细胞完整性途径，高渗透压甘油激酶途径，低压/外界激素刺激激酶途径，孢子形成激酶途径中的至少一种；优选的，所述的MAPK途径为细胞完整性途径中的级联激酶途径。
[0009]所述的激酶基因为基因Bck1、Mkk2、MpkA、SteC、PkaC中的至少一种；优选的，所述的激酶基因为基因MpkA。
[0010]所述的基因Bck1的核苷酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g06830，基因Mkk2的核苷酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An18g03740，基因MpkA的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM 025594238.1，基因SteC的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM 025594636.1基因MpkA的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM 025603413.1。
[0011]所述的基因Bck1编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g06830，基因Mkk2编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An18g03740，基因MpkA编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An01g09520，基因SteC编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An17g01280，基因PkaC编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g04270。
[0012]所述的丝状真菌为黑曲霉，米曲霉，土曲霉，构巢曲霉，烟曲霉中的至少一种；优选的，所述的丝状真菌为黑曲霉；更优选为黑曲霉(Aspergillus niger CBS513.88)。
[0013]所述的激酶基因被敲除或沉默后，丝状真菌的菌丝结构呈短杆状，分支少，极化生长周期短，不产分生孢子等表型出现，且分泌总蛋白的能力变强。
[0014]所述的敲除或沉默为使用包括CRISPR、siRNA、碱基突变等技术对激酶基因的核苷酸序列进行敲除或编辑/突变/沉默，使激酶基因不表达；优选为使用CRISPR技术进行敲除或沉默；更优选为使用RNP基因编辑体系敲除或沉默。
[0015]本专利技术所述的应用，具体包括如下步骤：
[0016](1)制备丝状真菌的原生质体；
[0017](2)敲除或沉默激酶基因；
[0018](3)在筛选平板上筛选，得到菌丝形态改变的丝状真菌。
[0019]所述的敲除或沉默为使用RNP基因编辑体系，具体步骤如下：
[0020](a)根据需要敲除或沉默的激酶基因设计sgRNA和修复片段；
[0021](b)将sgRNA与Cas9酶组装，孵育得到RNP基因编辑体系；
[0022](c)在丝状真菌原生质体中加入sgRNA和修复片段，孵育，实现激酶基因的敲除或沉默。
[0023]所述的sgRNA，是将启动子、spacer RNA与sgRNA骨架按顺序组装得到的。
[0024]所述的启动子为T7或U6启动子中的至少一种；优选为T7启动子。
[0025]当需要敲除的为基因MpkA时，所述的spacer RNA为其核苷酸序列中正向的第12个到第31个的序列。
[0026]当需要敲除的为基因SteC时，所述的spacer RNA为其核苷酸序列中正向的第28个到第47个的序列。
[0027]当需要敲除的为基因PkaC时，所述的spacer RNA为其核苷酸序列中正向的第262个到第281个的序列。
[0028]所述的修复片段包括筛选标签以及上下游同源臂，上下游同源臂的长度为39bp～1500bp。
[0029]所述的修复片段，是将spacer RNA位点的前39bp上游同源序列、筛选标签和spacer RNA位点的后39bp下游同源序列按顺序组装得到的。
[0030]所述的筛选标签为ANpyrG筛选标签。
[0031]一种黑曲霉突变株，是黑曲霉敲除了上述的激酶基因得到的，提高了菌株分泌总蛋白的能本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.激酶基因在调控丝状真菌菌丝形态中的应用，其特征在于：所述的激酶基因为丝状真菌MAPK途径和/或cAMP
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PKA途径上的激酶基因。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的激酶基因为基因Bck1、Mkk2、MpkA、SteC、PkaC中的至少一种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因Bck1的核苷酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g06830，基因Mkk2的核苷酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An18g03740，基因MpkA的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM 025594238.1，基因SteC的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM 025594636.1基因MpkA的核苷酸序列的NCBI数据库序列登记号为XM 025603413.1。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的基因Bck1编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g06830，基因Mkk2编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An18g03740，基因MpkA编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An01g09520，基因SteC编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An17g01280，基因PkaC编码的蛋白质的氨基酸序列的FungiDB数据库序列登记号为An02g04270。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的丝状真菌为黑曲霉，米曲霉，土曲霉，构巢曲霉，烟曲霉中的至少一种。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的激酶基因被敲除或沉默后，丝状真菌的菌丝结构呈短杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，喻乐意，王斌，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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