一种用于RNA递送的转染复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体提供了一种用于RNA递送的转染复合物及其制备方法和应用。本发明专利技术用于RNA递送的转染复合物包括生物纳米囊泡复合物和目的RNA，生物纳米囊泡复合物通过阳离子聚合物修饰生物纳米囊泡分子形成；生物纳米囊泡复合物和目的RNA共孵育得到转染复合物。本发明专利技术提供的这种转染复合物粒径均一，性质稳定，纳米微粒生物相容性好，安全性高，能够简单、高效地用于生物体内RNA递送，能够在超声辐照介导下产生空化效应并将RNA分子靶向递送到细胞内部。转染复合物可以同时递送多种RNA，并可在超声介导下递送到生物体内不同组织器官，还可在体内递送过程中通过超声造影成像实时可视化超声靶向递送RNA过程。造影成像实时可视化超声靶向递送RNA过程。造影成像实时可视化超声靶向递送RNA过程。

【技术实现步骤摘要】
一种用于RNA递送的转染复合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种用于RNA递送的转染复合物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]RNA疗法指利用具有治疗疾病功能的核酸从根源上调控致病基因表达的疗法。RNA疗法设计制备简便、安全性较高，与基因疗法相比，mRNA的表达由于无插入基因组的风险而较为安全，与以蛋白质为靶点的传统靶向药物相比，RNA疗法具有设计简便、研发周期短、候选靶点丰富等多重技术优势，近年来化学修饰技术以及递送系统的进步，RNA疗法研究早期所面临的在体稳定性、靶向性、免疫原性等问题也得以解决。
[0003]RNA药物常用于肿瘤，传染性，遗传性等疾病，不同于小分子药物,RNA药物必须到细胞浆内才能够发挥效用。然而,多种细胞和组织屏障阻碍了RNA转染至细胞，从而影响RNA药物的疗效。裸露RNA对细胞或组织中的核酸酶敏感且具有一定的免疫原性，易被核酸酶降解，并且被免疫系统识别并清除；其次，RNA药物由于其负电荷和高分子性质,使其难以进入细胞发挥效用。另外，对于被内吞进入胞内的RNA药物会被滞留在内体/溶酶体中，仅有效实现溶酶体中逃逸的RNA分子才能在细胞浆中真正发挥其生物学效应。因此，需要设计安全高效的载体系统将其递送至靶组织、器官内。
[0004]目前处于临床试验阶段的用于RNA药物递送载体主要包括脂质体、聚合物、多肽以及外泌体等。其中脂质体作为最广泛的RNA递送载体，其包括阳离子脂质体复合物，脂质体纳米粒(LNP)，阳离子纳米乳等。阳离子聚合物与核酸过量能够混合形成静电结合的阳离子聚合物，可以被广泛运用于核酸递送，但由于非修饰的阳离子聚合物靶向性不足，这些RNA递送载体会在递送过程中在肝脏中富集，难以靶向其他部位，在临床上具有潜在的毒副作用。所以RNA药物能够特异性地靶向致病基因可以使治疗过程更加精准和个性化，但目前RNA药物的靶向性仍然存在非常大的挑战。超声靶向微泡破坏(UTMD)是一种超声治疗技术，可用于将RNA定向特异性递送至超声可及的靶器官。利用低频超声与微泡结合以触发微泡空化，导致微泡附近的生物膜通透性增加，使RNA药物更容易穿透血管递送至细胞内，提高药物分子在病灶区域的生物利用率或基因的转染效率。同时，微泡是一种优良的递送载体，不仅可以保护药物分子或基因在运输过程中免受内源性清除，还能够通过惯性空化作用在病灶区域进行受控释放。RNA的负电荷使其很难自行穿过细胞膜，以纳米粒子作为载体包裹RNA可以提升RNA在体内的稳定性，超声产生空化效应下可以打开血脑屏障，富集并释放RNA药物，从而解决血脑屏障的存在使治疗药物无法从血液进入大脑，聚焦超声联合纳米技术可以高效的向脑肿瘤递送RNA药物并促使肿瘤细胞死亡有望带来治疗脑肿瘤的新临床疗法，为治愈此类恶性脑肿瘤带来新的希望。因此，开发一种在体超声可视化RNA递送系统对于临床应用具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种在体超声可视化RNA递送系统。
[0006]为此，本专利技术提供了一种用于RNA递送的转染复合物，包括生物纳米囊泡复合物和目的RNA，所述生物纳米囊泡复合物通过阳离子聚合物修饰生物纳米囊泡分子形成；所述生物纳米囊泡复合物和所述目的RNA共孵育得到所述转染复合物。所得转染复合物粒径为1000
‑
3000nm，zeta电位为
‑
10
‑
+10。
[0007]具体的，上述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、含季铵盐类的阳离子聚合物、壳聚糖及其衍生物中的至少一种。优选的，所述聚乙烯亚胺包括线性化聚乙烯亚胺Mw25000。
[0008]具体的，上述生物纳米囊泡的来源包括从天然含泡微生物中分离的生物纳米囊泡或从基因工程含泡微生物中分离的生物纳米囊泡。所述天然含泡微生物优选包括嗜盐古菌、藻类和巨大芽孢杆菌中任意一种或至少两种的组合。所述基因工程含泡微生物中含有至少一个拷贝的携带生物气囊基因簇的质粒，所述基因工程含泡微生物的底盘细胞包括大肠杆菌、链霉菌、酵母、蓝细菌和恶臭假单胞菌中任意一种或至少两种的组合。
[0009]具体的，上述目的RNA包括mRNA、rRNA、tRNA、lncRNA、miRNA、siRNA或circRNA。
[0010]本专利技术还提供了上述用于RNA递送的转染复合物的制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)配制阳离子聚合物溶液：优选将阳离子聚合物用去离子水或PBS配置成0.1
‑
10mg/ml的溶液。
[0012](2)用缓冲液将生物纳米囊泡的OD
500
配置成为0.5
‑
2.5；
[0013](3)将步骤(2)中生物纳米囊泡逐滴加入到阳离子聚合物溶液中进行孵育；待孵育完成后，离心去除游离的阳离子聚合物，收集上层悬浮物，将悬浮物分散在无菌无酶的PBS中，得到阳离子修饰后的生物纳米囊泡复合物；
[0014](4)将生物纳米囊泡复合物与目的RNA进行共孵育，待孵育完成后，离心去除游离的RNA；收集上层悬浮物，将悬浮物分散在无菌无酶的PBS中，得到转染复合物。
[0015]具体的，上述步骤(3)中阳离子聚合物溶液与生物纳米囊泡的体积比为(1
‑
5):(1
‑
10)；所述步骤(4)中目的RNA与生物纳米囊泡复合物中的阳离子聚合物的质量比为(1
‑
5):1。
[0016]具体的，上述步骤(4)中将含有目的RNA的水溶液滴加到生物纳米囊泡复合物水溶液中，轻轻搅拌混匀，放置于摇床进行孵育。
[0017]具体的，上述步骤(3)和步骤(4)中孵育温度均为25
‑
50℃，孵育反应时间均为20
‑
100min。离心的离心力为200
‑
300g，离心时间为30
‑
60min。
[0018]本专利技术还提供了一种在体超声可视化RNA递送方法，包括以下步骤：制备上述用于RNA递送的转染复合物，将所述转染复合物与细胞或组织器官共孵育后以超声介导RNA递送。
[0019]具体的，上述转染复合物与细胞或组织器官共孵育1
‑
30min后，对细胞或组织器官进行超声破碎处理。
[0020]具体的，上述超声过程中超声强度为0.2
‑
3w/cm2，超声声压为0.2
‑
1MPa，占空比为5
‑
50％，超声时间为5
‑
180s。
[0021]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：
sp.NRC
‑
1(简称NRC
‑
1)。从NRC
‑
1中提取生物纳米囊泡。将pH为7.5的裂解液与所述NRC
‑
1按体积比为2:1混合裂解，将裂解后的溶液在离心力为300g的条件下离心4h，上层悬浮物即所述纳米生物气囊；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于RNA递送的转染复合物，包括生物纳米囊泡复合物和目的RNA，其特征在于：所述生物纳米囊泡复合物通过阳离子聚合物修饰生物纳米囊泡分子形成；所述生物纳米囊泡复合物和所述目的RNA共孵育得到所述转染复合物。2.如权利要求1所述的用于RNA递送的转染复合物，其特征在于：所述阳离子聚合物包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、含季铵盐类的阳离子聚合物、壳聚糖及其衍生物中的至少一种。3.如权利要求1所述的用于RNA递送的转染复合物，其特征在于：所述生物纳米囊泡包括从天然含泡微生物中分离的生物纳米囊泡或从基因工程含泡微生物中分离的生物纳米囊泡。4.如权利要求1所述的用于RNA递送的转染复合物，其特征在于：所述目的RNA包括mRNA、rRNA、tRNA、lncRNA、miRNA、siRNA或circRNA。5.如权利要求1
‑
4任意一项所述的用于RNA递送的转染复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制阳离子聚合物溶液；(2)用缓冲液将生物纳米囊泡的OD
500
配置成为0.5
‑
2.5；(3)将步骤(2)中生物纳米囊泡逐滴加入到阳离子聚合物溶液中进行孵育；待孵育完成后，离心去除游离的阳离子聚合物，收集上层悬浮物，将悬浮物分散在无菌无酶的PBS中，得到阳离子修饰的生物纳米囊泡复合物；(4)将生物纳米囊泡复合物与目的RNA进行共孵育，待孵育完成后，离心去除游离的RNA；收集上层悬浮物，将悬浮物分散...

【专利技术属性】
技术研发人员：严飞，刘辰星，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：