靶向清除细菌耐药性的方法技术

本发明专利技术公开了一种靶向清除细菌耐药性的方法，该方法包括以下步骤：将靶向抗生素抗性基因的核酸分子与带有锋利边缘的纳米载体组装，得到靶向复合体，核酸分子包括编码CRISPR相关核酸酶的第一序列和生成靶向抗生素抗性基因的sgRNA的第二序列；将靶向复合体与细菌接触，通过纳米载体的物理穿刺作用将核酸分子递送到细菌内，敲除细菌的所述抗生素抗性基因。考虑到细菌细胞壁的刚性要弱于植物细胞壁的刚性，因此采用带有锋利边缘的纳米颗粒作为载体对细菌的细胞壁和细胞膜进行物理穿刺，实现外源核酸分子在细菌上的跨膜转运，从而实现外源CRISPR系统的递送，通过这种方式递呈ARG

【技术实现步骤摘要】
靶向清除细菌耐药性的方法


[0001]本申请涉及抗性基因
，尤其是涉及靶向清除细菌耐药性的方法。

技术介绍

[0002]抗生素在抑制细菌感染方面具有重要作用，但其广泛使用也引起了细菌的抗生素选择压力，诱导了大量的抗生素耐药细菌(Antibiotics Resistance Bacterias，ARBs)和抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)。细菌(尤其是致病菌)的耐药性增加，ARGs也在人类致病菌间传播扩散，造成了全球性的健康问题。与传统化学污染物不同，ARGs不仅会在不同环境介质中持续残留、转移和扩散(易获得，难去除)，而且具有暴发性的特征，一旦失控，将严重威胁公共安全。因此，寻找遏制耐药性传播的方法已成为目前国内外的热点问题。目前去除ARGs的方法包括生物、化学、物理以及结合处理等几类，如电离辐射、低温热处理、高级氧化、消毒、好氧堆肥、厌氧消化等广谱杀菌方法，这些方法虽然能大幅降低群落整体的ARGs丰度水平，但由于其缺乏对耐药菌的针对性，并不能完全杀灭耐药菌，甚至会因为其对有益微生物的灭杀作用和对微生物群系整体施加的选择压力加剧ARGs的水平基因转移(Horizontal Gene Transfer，HGT)，最终促进了ARGs的传播。
[0003]新兴的CRISPR
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Cas基因编辑技术具有高度序列特异性的识别和编辑能力，有望用于靶向性清除耐药菌所携带的ARGs。该技术的主要瓶颈在于如何高效地将ARG
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CRISPR系统导入耐药菌细胞内部。目前可行的递呈ARG
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CRISPR的方式主要是质粒转化和温和噬菌体侵染两种方式，然而前者依赖于细菌外源DNA转化的实验方法，无法实现ARG
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CRISPR的主动进入，难以在实验室以外的环境下开展；后者同样存在噬菌体宿主特异性、制备步骤繁琐、潜在的抗药性扩散等问题。上述递呈系统的缺点明显限制了ARG
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CRISPR在清除细菌耐药性中的应用，因此需要一种新型的ARG
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CRISPR递呈系统来打破耐药菌宿主特异性的限制并且实现ARG
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CRISPR的主动进入。
[0004]纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)具有较大比表面积和较好的生物兼容性，能够高效负载并保护核酸，因而在植物基因工程中方法中设计了基于NPs的递呈系统，部分研究显示，仅仅通过将NPs
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质粒复合体喷洒于未经任何处理的植物叶片表面就可以实现质粒向植物细胞的瞬时转化。然而，植物细胞与细菌存在诸多不同。例如，植物细胞大小一般在10～20μm，而细菌细胞通常在5μm以下，这就导致细胞表面能够附着的NPs的量急剧减少。更重要的是，胞吞是植物细胞中摄取NPs完成递呈的主要机制，但细菌和植物细胞的结构存在巨大差异，其表面不存在可以进行胞吞的结构。因此，有必要设计ARG
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CRISPR递呈系统从而高效实现对细菌耐药性的靶向清除。

技术实现思路

[0005]本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种靶向清除细菌耐药性的方法，该方法利用ARG
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CRISPR递呈系统，能够高效清除ARGs。
[0006]本申请的第一方面，提供一种靶向清除细菌耐药性的方法，该方法包括以下步骤：
[0007]将靶向抗生素抗性基因的核酸分子与带有锋利边缘的纳米载体组装，得到靶向复合体，所述核酸分子包括编码CRISPR相关核酸酶的第一序列和生成靶向所述抗生素抗性基因的sgRNA的第二序列；
[0008]将所述靶向复合体与细菌接触，通过所述纳米载体的物理穿刺作用将所述核酸分子递送到所述细菌内，敲除所述细菌的所述抗生素抗性基因。
[0009]根据本申请实施例的方法，至少具有如下有益效果：
[0010]考虑到细菌细胞壁的刚性要弱于植物细胞壁的刚性，因此采用带有锋利边缘的纳米颗粒作为载体对细菌的细胞壁和细胞膜进行物理穿刺，实现外源核酸分子在细菌上的跨膜转运，从而实现外源CRISPR系统的递送，通过这种方式递呈ARG
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CRISPR来靶向清除细菌耐药性。而且，这些带有锋利边缘的纳米颗粒不仅可以作为基因载体，而且还具有抑制细菌间ARGs水平基因转移的能力，可以成为抗多耐药性细菌的潜在手段，从而在消除耐药性的同时阻止耐药性的传播，起到一石二鸟的效果。
[0011]在本申请的一些实施方式中，所述锋利边缘满足所述纳米载体的边缘具有向外的1～100层的原子层。进一步的，可以是1～50层的原子层、1～30层的原子层、1～20层的原子层、1～10层的原子层、1～5层的原子层、1～3层的原子层、1～2层的原子层、单原子层。其中，向外的方向是指边缘处远离纳米载体的中心的方向。
[0012]在本申请的一些实施方式中，所述纳米载体选自碳基纳米载体(如碳纳米管、碳点、石墨烯)等其中的至少一种。其中，碳纳米管包括但不限于单壁碳纳米管(SWCNT)、多壁碳纳米管(MWCNT)；碳点包括但不限于碳量子点(CQDs)、石墨烯量子点(GQDs)等；石墨烯包括但不限于石墨烯、氧化石墨烯、还原氧化石墨烯等，而根据其层数又可以分为单层石墨烯、双层石墨烯、少层石墨烯(3～10层)、多层石墨烯(10层以上10nm以下)。
[0013]在本申请的一些实施方式中，纳米载体的大小不超过5μm，进一步其大小不超过3μm、2μm、1μm，，例如在0.1～5μm，0.1～3μm，0.1～2μm、0.1～1μm。其中，大小是指纳米载体在任一方向上的两端距离的最大值，例如其为管状或片状时，大小即为其长度。
[0014]在本申请的一些实施方式中，组装为所述纳米载体与所述核酸分子在静电作用力下发生组装。通常核酸分子如DNA带有负电荷，因此可以通过选取带有正电荷的纳米载体使两者可以在静电作用力下相互吸引而进行组装。
[0015]在本申请的一些实施方式中，所述组装包括以下步骤：
[0016]对所述纳米载体的表面进行活化，然后连接上阳离子材料，得到阳离子化的纳米载体；
[0017]将所述阳离子化的纳米载体与所述核酸分子混合孵育，在静电作用力下使所述核酸分子组装到所述阳离子化的纳米载体上，得到靶向复合体。
[0018]在本申请的一些实施方式中，所述活化采用EDC(N
‑
(3
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二甲基丙基)
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乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N
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羟基琥珀酰亚胺)进行羧基活化处理。
[0019]在本申请的一些实施方式中，EDC以及NHS的摩尔比为1：(0.25～4)，进一步EDC以及NHS的摩尔比为1：(0.5～2)，1：(0.66～1.5)。
[0020]在本申请的一些实施方式中，纳米载体与EDC的质量比为1：(1～10)，进一步纳米载体与EDC的质量比为1：(3～8)。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向清除细菌耐药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将靶向抗生素抗性基因的核酸分子与带有锋利边缘的纳米载体组装，得到靶向复合体，所述核酸分子包括编码CRISPR相关核酸酶的第一序列和生成靶向所述抗生素抗性基因的sgRNA的第二序列；将所述靶向复合体与细菌接触，通过所述纳米载体的物理穿刺作用将所述核酸分子递送到所述细菌内，敲除所述细菌的所述抗生素抗性基因；优选地，所述锋利边缘满足所述纳米载体的边缘具有向外的1～100层的原子层。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米载体选自碳纳米管、碳点、石墨烯中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组装为所述纳米载体与所述核酸分子在静电作用力下发生组装。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组装包括以下步骤：对所述纳米载体的表面进行活化，然后连接上阳离子材料，得到阳离子化的纳米载体；将所述阳离子化的纳米载体与所述核酸分子混合孵育，在静电作用力下使所述核酸分子组装到所述阳离子化的纳米载体上，得到靶向复合体；优选地，所述活化采用EDC和NHS进行羧基活化处理。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述阳离子材料选自聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、精胺、亚精胺、聚组氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、壳聚糖、咪唑鎓中的至少一种。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPR相关核酸酶选自Cas、Csa、Csb、Csc、Cse、Csf、Csm、Csn、Csx、Csy、Cmr中的至少一种。7.根据权利要求1所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏雨，于凯强，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：