IL-8为靶点在抑制猪流行性腹泻病毒感染及疫苗生产中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及IL

【技术实现步骤摘要】
IL
‑
8为靶点在抑制猪流行性腹泻病毒感染及疫苗生产中的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及IL
‑
8为靶点在抑制猪流行性腹泻病毒感染及疫苗生产中的应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的病毒性传染病，患病猪主要表现出腹泻、呕吐、厌食、脱水以及体重下降等临床症状。成年猪多呈现出隐形感染，而初生仔猪多为重症感染，致死率可以高达100％。该病自1971年发现以来，在世界范围内发生了多次大流行，给生猪养殖行业带来了巨大的经济损失。PED主要危害初生一周内的仔猪，PED的预防依赖于母猪免疫产生的乳源性抗体进行保护，因而疫苗免疫很难较好的控制该病的发生。因此，开发相关预防治疗用药对于防控PED具有十分重要的临床意义。
[0003]IL
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8又可以称为CXCL8，是典型的CXC家族成员，IL
‑
8基因编码的前体蛋白需要经过蛋白酶切割为成体蛋白，形成可溶性的二聚体来发挥作用。对中性粒细胞与部分T细胞亚群具有重要的趋化作用，在一些慢性炎症型疾病中IL
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8处于高水平表达，比如类风湿性关节炎、肺部疾病、牛皮癣等。
[0004]本专利技术意外发现，过表达IL
‑
8可以增加PEDV在细胞内的增殖，可以用于PEDV病毒的培养以及疫苗生产；而敲除或者抑制IL
‑
8则能够抑制PEDV的复制，可作为靶点筛选抑制猪流行性腹泻病毒感染的药物。

技术实现思路

[0005]针对上述技术问题，本专利技术首先发现，IL
‑
8在PEDV感染上皮细胞中起着积极作用，抑制IL
‑
8能够抑制PEDV的复制；而过表达IL
‑
8则可以增加PEDV在细胞内的增殖，可以用于PEDV病毒的培养以及疫苗生产。具体包括以下内容：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种IL
‑
8作为靶点在筛选用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用，所述药物以IL
‑
8为靶点抑制/沉默/干扰IL
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8的表达。
[0007]第二方面，本专利技术提供了一种抑制/沉默/干扰IL
‑
8表达的试剂在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。
[0008]第三方面，本专利技术提供了一种IL
‑
8或IL
‑
8表达促进剂作为猪流行性腹泻病毒表达增效剂或生产增效剂的应用。
[0009]第四方面，本专利技术提供了一种IL
‑
8过表达细胞系在制备猪流行性腹泻病毒或病毒疫苗生产细胞系中的应用。
[0010]第五方面，本专利技术提供了一种IL
‑
8基因敲除细胞系在制备抗猪流行性腹泻病毒动物育种细胞系中的应用。
[0011]第六方面，本专利技术提供了一种促进猪流行性腹泻病毒复制的细胞系的制备方法，
其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段使生产细胞中IL
‑
8表达或过表达。
[0012]优选地，所述方法包括以下步骤：
[0013](1)将IL
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8基因克隆到真核过表达载体；
[0014](2)将步骤(1)制备的重组载体转染宿主细胞获得。
[0015]第七方面，本专利技术提供了一种特异性靶向IL
‑
8的sgRNA，所述sgRNA的序列如下所示：
[0016]IL8
‑
sgRNA
‑
F：CATGACTTCCAAGCTGGCGG(SEQ ID NO.1所示)；
[0017]IL8
‑
sgRNA
‑
R：CCGCCAGCTTGGAAGTCATG(SEQ ID NO.2所示)。
[0018]第八方面，本专利技术提供了一种抗猪流行性腹泻病毒的动物育种细胞系的制备方法，所述方法为：通过基因工程手段使细胞中的IL
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8敲低或丧失。
[0019]优选地，所述方法包括以下步骤：
[0020](1)制备特异性靶向IL
‑
8基因的sgRNA；
[0021](2)将步骤(1)制备的sgRNA插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；
[0022](3)将步骤(2)制备的重组载体包装慢病毒感染宿主细胞，嘌呤霉素筛选后挑取单个细胞，接种培养，获得IL
‑
8基因功能缺失细胞系。
[0023]优选地，所述宿主细胞为Vero细胞。
[0024]优选地，所述sgRNA的序列如下所示：
[0025]IL8
‑
sgRNA
‑
F:CATGACTTCCAAGCTGGCGG(SEQ ID NO.1所示)；
[0026]IL8
‑
sgRNA
‑
R:CCGCCAGCTTGGAAGTCATG(SEQ ID NO.2所示)。
[0027]第八方面，本专利技术提供了一种培养猪流行性腹泻病毒或制备猪流行性腹泻病毒疫苗的方法，所述方法为将猪流行性腹泻病毒接种在IL
‑
8过表达细胞系中培养。
[0028]本专利技术的有益效果是：本专利技术首先发现敲除IL
‑
8能够显著抑制PEDV N mRNA和PEDV N蛋白的表达量、抑制PEDV子代病毒的生成，即敲除IL
‑
8能够显著抑制PEDV的复制，基于此，IL
‑
8作为靶点能够用于筛选抗PEDV感染的药物，即能够抑制或沉默IL
‑
8表达的试剂可以作为抗PEDV感染的药物，用于预防或治疗PED，为PED的治疗提供一种新思路；其次，过表达IL
‑
8能够显著促进PEDV N mRNA和PEDV N蛋白的表达，即过表达IL
‑
8能够显著促进PEDV的复制。基于此，促进IL
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8表达的试剂能够用于PEDV或PEDV疫苗的生产增效剂；而且过表达IL
‑
8的细胞可作为PEDV或PEDV疫苗生产细胞系，用于PEDV或PEDV疫苗的生产。
附图说明
[0029]为了更清楚的说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式和用途作进一步详细说明。
[0030]图1为IL
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8敲除细胞系的Sanger sequencing鉴定；
[0031]图2为IL
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8敲除对病毒在上皮细胞中的基因转录水平的测定；
[0032]图3为IL
‑
8敲除对病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.IL
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8作为靶点在筛选用于预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述药物以IL
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8为靶点抑制/沉默/干扰IL
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8的表达。2.抑制/沉默/干扰IL
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8表达的试剂在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用。3.IL
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8或IL
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8表达促进剂作为猪流行性腹泻病毒表达增效剂或生产增效剂的应用。4.IL
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8过表达细胞系在制备猪流行性腹泻病毒或病毒疫苗生产细胞系中的应用。5.IL
‑
8基因敲除细胞系在制备抗猪流行性腹泻病毒动物育种细胞系中的应用。6.一种促进猪流行性腹泻病毒复制的细胞系的制备方法，其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段使生产细胞中IL
‑
8表达或过表达。7.一种特异性靶向IL
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8的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列如下所示：IL8
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【专利技术属性】
技术研发人员：肖书奇，郭旭阳，郑海学，赵晓静，马志倩，李志伟，李洋，郑紫方，冯英桐，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：