一种韦塞尔斯布朗病基因的检测试剂、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂，其特征在于：包括：PCR特异性引物。所述的引物序列(5

【技术实现步骤摘要】
一种韦塞尔斯布朗病基因的检测试剂、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及韦塞尔斯布朗病基因的检测方法领域，具体涉及韦塞尔斯布朗病基因的检测试剂、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]韦塞尔斯布朗病是一种经蚊虫传播的人兽共患传染病，由韦塞尔斯布朗病病毒引起。本病最早报道于1954年，感染羊和其他一些反刍动物，主要引起羔羊的急性死亡，死亡率可高达50％，偶尔会感染人。对我国尚属外来病，目前并无针对该病的检测方法，尚属空白。随着我国与非洲国家经济贸易交流的快速增长和不断扩大，该病传入我国的风险日趋严重，目前，还没有针对韦塞尔斯布朗病基因的快速，有效的检测试剂盒。

技术实现思路

[0003]为了解决现有技术中疗效不理想的问题，本专利技术从基因学方面提供了治疗方案。
[0004]本专利技术的技术方案为:
[0005]一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂，包括：PCR特异性引物。
[0006]所述的引物序列(5
’‑3’
)为：CRCAAATGTGGCTGTTGATGTAYTT；和/或GACTTTGGCAGATARGGAATGTCTCKC。
[0007]所述的一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂在制备动物血液样品中病毒检测试剂盒中的应用。
[0008]一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂盒，包括权利要求1所述的一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂。
[0009]所述的检测试剂盒，反应体系为2
×
One
‑
Step RT
‑<br/>PCR Mix,One Step Enzyme Mix。
[0010]所述的检测试剂盒，反应体系为2
×
One
‑
Step RT
‑
PCR Mix 6
‑
15μL,One Step Enzyme Mix 0.2
‑
2μL,上游引物1
‑
3μL,下游引物1
‑
3μL,模板1
‑
3μL,灭菌水补足15
‑
30μL。
[0011]所述的检测试剂盒，反应程序为：40
‑
60℃反转录20
‑
40min，80
‑
100℃预变性1
‑
5min后进入PCR扩增阶段，90
‑
100℃20
‑
40s，50
‑
60℃20
‑
40s，68
‑
78℃20
‑
40s，共30
‑
40个循环，最后68
‑
78℃终延伸3
‑
9min。
[0012]所述的检测试剂盒在检测韦塞尔斯布朗病基因中的应用。
[0013]一种韦塞尔斯布朗病基因检测方法：
[0014](1)提取待检测对象的核酸样品；
[0015](2)利用权利要求1所述的检测试剂或权利要求4所述的检测试剂盒对所述核酸样品进行PCR扩增；
[0016](3)对进境动物血液样品进行韦尔斯布朗病检测。所述的动物包括羊、马。
[0017]本专利技术的检测方法能够进行快速、及时、准确的诊断韦塞尔斯布朗病。韦塞尔斯布朗病目前主要发生在非洲，但是随着我国与非洲国家交往的不断加强，国际贸易范围不断
扩大，韦塞尔斯布朗病传入我国的风险不断加大，我国已明确将其列入从非洲进口反刍动物议定书的检疫要求中，目前我国对该病的系统研究和技术储备等均处于空白状态，建立该病的PCR检测方法，十分必要而且迫在眉睫。
[0018]根据韦塞尔斯布朗病的保守基因序列设计特异性上游引物和下游引物，利用设计的引物对保存的质粒进行检测，初步建立RT
‑
PCR的检测方法，并对特异性和敏感性进行检测，效果显著。
[0019]本专利技术利用RT
‑
PCR技术探索韦尔斯布朗的检测方法，以主要的生物安全因子为关键点，建立可以快速检测相关生物安全因子的检测体系，从而为进境生物制品的生物安全保驾护航。本专利技术公开了针对韦尔斯布朗的引物，并对其进行特异性和敏感性检测，对实际样品的检测，建立可特异性检测韦尔斯布朗的PCR,荧光PCR方法，填补空白。
附图说明：
[0020]图1：RT
‑
PCR特异性试验；
[0021]注：1、2、3：其他病原；4：WSLV；M：DL2000；
[0022]图2：RT
‑
PCR灵敏度试验；
[0023]注：1
‑
8：108
‑‑
101拷贝/μL；9：阴性对照；M：DL2000。
具体实施方式
[0024]为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例对本专利技术做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。
[0025]下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从常规的生化试剂商店或公司购买得到的。
[0026]实施例1：PCR检测方法
[0027]1.1引物
[0028]根据韦塞尔斯布朗病基因核酸序列设计，扩增长度约为250bp，用ddH2O溶解至10umol/L后，保存于
‑
20℃备用。
[0029]表1PCR检测引物
[0030][0031]1.2阴性对照、阳性对照设置
[0032]以超纯水代替DNA模板作为空白对照，以含有检测序列的DNA模板(或质粒)为阳性对照，以不含有检测序列的DNA模板为阴性对照。
[0033]1.3PCR反应体系
[0034]12.5μL 2
×
One
‑
Step RT
‑
PCR Buffer,1μL PrimeScript 1Step Enzyme Mix，上下游引物(10μmol/L)各1ul，模板2μL。反应程序为：50℃反转录30min，95℃预变性2min后进
入PCR扩增阶段，95℃30s，55℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃终延伸5min。
[0035]1.4特异性反应
[0036]将保存的黄病毒成员病毒核酸(西尼罗、日本脑炎、坦布苏)进行特异性试验，结果见图1，结果表明建立的RT
‑
PCR反应体系有良好的特异性。
[0037]1.5敏感性反应
[0038]将RNA标准品以108
‑
101拷贝稀释度为模板，检测结果见图2。结果表明建立的RT
‑
PCR反应体系有良好的敏感性.
[0039]实施例2：
[0040]一种韦塞尔斯布朗病基因检测试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂，其特征在于：包括：PCR特异性引物。2.根据权利要求1所述的一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂，其特征在于：所述的引物序列如SEQ ID NO.1所示：CRCAAATGTGGCTGTTGATGTAYTT；和/或如SEQ ID NO.2所示，GACTTTGGCAGATARGGAATGTCTCKC。3.权利要求1所述的一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂在制备动物血液样品中病毒检测试剂盒中的应用。4.一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的一种韦塞尔斯布朗病基因检测试剂。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：反应体系为2
×
One
‑
Step RT
‑
PCR Mix,One Step Enzyme Mix。6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：反应体系为2
×
One
‑
Step RT
‑
PCR Mix 6
‑
15μL,One Step Enzyme Mix 0.2
‑
2μL,上游引物1
‑
3μL,下游引物1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳，冯之航，薛俊欣，杨晓伟，赵光伟，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：