本发明专利技术提供了一种用于检测人细小病毒B19的荧光PCR检测引物及其试剂盒，包括用于检测人细小病毒靶标核酸的上游引物序列，如SEQ ID NO.1所示；下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；用于检测人细小病毒靶标核酸的探针序列，如SEQ ID NO.3所示；内标的上游引物序列，如SEQ ID NO.4所示；内标的下游引物序列，如SEQ ID NO.5所示；内标的探针序列，如SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术设计的引物、探针灵敏度高，特异性好；试剂盒操作简单，全程只需不到2h，并且内标参与全程监控。程监控。程监控。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测人细小病毒B19的引物及其试剂盒
[0001]本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种检测试剂，具体来说是一种检测人细小病毒B19的引物、探针和试剂盒。
技术介绍
[0002]人细小病毒B19(parvovirus B19，简称B19病毒)属于细小病毒科(Parvoviridaefamily)，红病毒属(Erythrovirusgenus)，无包膜，是单链线状DNA病毒。可以被分为1、2、3三种基因型，其中1型和3型又各自分为两种亚型。B19病毒感染在人群中普遍存在，可通过呼吸道、血液、胎盘等进行传播，并且可在各年龄段中发生，尤其在孕妇和儿童中多见。易感人群还包括免疫功能缺陷或者不全的患者及贫血患者。儿童感染后最常引发传染性红斑；免疫力正常人群感染后一般为轻型自限性症状；孕妇感染可造成胎儿水肿和贫血，严重时导致胎儿死亡；先天免疫缺陷患者、获得性免疫缺陷患者、肿瘤或器官移植手术后进行化疗的患者感染会导致慢性贫血症；镰状细胞贫血症等血液系统疾病患者感染会发生一过性再生障碍性危象而导致急性贫血；部分感染患者会出现关节疼痛等症状，随后演变为多发性关节炎。
[0003]B19病毒的诊断检测主要包括血清学检测和病毒核酸检测两种。
[0004]B19血清学检测是目前B19病毒感染临床辅助诊断和流行病学调查研究的主要方法，而病毒核酸检测则能提供进一步的协助诊断。例如在免疫缺陷患者中，由于抗体产生不足，通常需要检测B19病毒DNA协助诊断；对于孕妇来说，通常将血清学抗体检测和病毒DNA水平联合应用。B19病毒核酸检测主要包括斑点杂交法、聚合酶链式反应(PCR)、原位杂交法(In situ hybridization)。其中斑点杂交法作为最初的B19病毒核酸检测方法，逐渐被灵敏的PCR法替代；PCR法包括普通PCR法以及更灵敏的巢式PCR法和荧光定量PCR法(qPCR),其中后两者是目前最常用的B19病毒核酸检测方法，常应用于病毒分型检测以及血液中B19病毒的大规模筛查。
[0005]B19检测采用基于PCR的方法，具有灵敏度高、准确度高等优点。通过荧光PCR方法直接检测B19 DNA，大大提高了B19感染的准确性，可用于早期诊断，还可作为疗效评价。
技术实现思路
[0006]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种检测人细小病毒B19的荧光PCR引物及其试剂盒，所述的这种检测人细小病毒B19的荧光PCR引物及其试剂盒要解决现有技术中检测人细小病毒B19的方法时间长、灵敏度不高的技术问题。
[0007]本专利技术提供了一种用于检测人细小病毒B19的荧光PCR检测引物，包括如下组份：
[0008]用于检测人细小病毒B19靶标核酸的上游引物序列，如SEQ ID NO.1所示；
[0009]用于检测人细小病毒B19靶标核酸的下游引物序列，如SEQ ID NO.2所示；
[0010]用于检测人细小病毒B19靶标核酸的探针序列，如SEQ ID NO.3所示。
[0011]本专利技术还提供了一种用于检测人细小病毒B19的荧光PCR检测试剂盒，包括：
[0012]用于检测人细小病毒B19靶标核酸的上游引物序列，如SEQ ID NO.1所示；
[0013]用于检测人细小病毒B19靶标核酸的下游引物序列，如SEQ ID NO.2所示；
[0014]用于检测人细小病毒B19靶标核酸的探针序列，如SEQ ID NO.3所示；
[0015]内标的上游引物序列，如SEQ ID NO.4所示；
[0016]内标的下游引物序列，如SEQ ID NO.5所示；
[0017]内标的探针序列，如SEQ ID NO.6所示。
[0018]进一步的，还包括内标，所述的内标的序列如SEQ ID No.7所示。
[0019]本专利技术还提供了采用上述的试剂检测HCV浓度的方法，包括如下步骤：
[0020]1)一个配制PCR反应液的步骤：包含有0.05U/ul
‑
0.1U/ul的DNA聚合酶，1.5mM
‑
5mM的Mg
2+
，0.1mM
‑
0.5mM的dNTP，10
×
PCR buffer，0.1uM
‑
0.4uM用于扩增靶标B19核酸的上游引物B19
‑
F，其序列如SEQ ID NO.1所示；0.1uM
‑
0.4uM用于扩增靶标B19核酸的下游引物B19
‑
R，其序列如SEQ ID NO.2所示；0.1uM
‑
0.2uM用于扩增靶标B19核酸的探针B19
‑
P，其序列如SEQ ID NO.3所示；0.1uM
‑
0.4uM用于扩增内标的上游引物IC
‑
F，其序列如SEQ ID NO.4所示；0.1uM
‑
0.4uM用于扩增内标的下游引物IC
‑
R，其序列如SEQ ID NO.5所示；0.1uM
‑
0.2uM用于扩增内标的探针IC
‑
P，其序列如SEQ ID NO.6所示；充分混匀，瞬时离心后备用；
[0021]2)将一定量的内标参考品，按比例加入到提取试剂裂解液中，与样本一同参与提取，将提取好的核酸作为模板备用；所述的内标的序列如SEQ ID No.7所示；
[0022]3)荧光PCR反应：将提取好的核酸DNA按比例加入到配制好的PCR反应液中，将PCR反应管加入扩增仪中，按对应样品设置好待测样本名称，荧光通道选择FAM、ROX通道，参比荧光设置为NONE；
[0023]反应参数如下：
[0024]25℃,5min；50℃，25min；95℃，2min；
[0025]5×
(95℃，15S；55℃，20S；72℃，20S；)
[0026]40
×
(95℃，10S；60℃，45S；采集荧光；)
[0027]4)反应结束后，调整基线的开始值、结束值以及阈值线后，进行分析。
[0028]本专利技术通过序列比对，根据B19病毒结构蛋白VP1基因序列设计特异性的引物和探针，通过荧光PCR扩增进行检测。
[0029]本专利技术和已有技术相比，其技术进步显著的。本专利技术设计的引物、探针灵敏度高，特异性好；试剂盒操作简单，全程只需不到2h，并且内标参与全程监控。
附图说明
[0030]图1显示了试验一：B19引物探针组1的扩增曲线。
[0031]图2显示了试验一：B19引物探针组2的扩增曲线。
[0032]图3显示了试验一：B19引物探针组3的扩增曲线。
[0033]图4显示了试验二：有内标的靶标扩增曲线。
[0034]图5显示了试验二：无内标的靶标扩增曲线。
[0035]图6显示了B19梯度稀释扩增曲线。
[0036]图7显示了本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测人细小病毒B19的荧光PCR检测引物，其特征在于包括如下组份：用于检测人细小病毒B19靶标核酸的上游引物序列，如SEQ ID NO.1所示；用于检测人细小病毒B19靶标核酸的下游引物序列，如SEQ ID NO.2所示；用于检测人细小病毒B19靶标核酸的探针序列，如SEQ ID NO.3所示。2.一种用于检测人细小病毒B19的荧光PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：用于检测人细小病毒B19靶标核酸的上游引物序列，如SEQ ID NO.1所示；用于检测人细小病毒B19靶标核酸的下游引物序列，如SEQ ID NO.2所示；用于检测人细小病毒B19靶标核酸的探针序列，如SEQ ID NO.3所示；内标的上游引物序列，如SEQ ID NO.4所示；内标的下游引物序列，如SEQ ID NO.5所示；内标的探针序列，如SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应液，所述的PCR反应液中含有0.05U/ul
‑
0.1U/ul的DNA聚合酶、1.5mM
‑
5mM的Mg
2+
、0.1mM
‑
0.5mM的dNTP、10
×
PCR buffer；阳性对照和阴性对照。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括内标，所述的内标的序列如SEQ ID No.7所示。5.采用权利要求2所述的试剂盒检测人细小病毒B19的方法，其特征在于包括如下步骤：1)一个配制B19反应液的步骤：包含有0.05U/ul
‑
0.1U/ul的DNA聚合酶，1.5mM
‑
5mM的Mg
2+
，0.1mM
‑
0.5mM的dNTP，10
×
...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘白朵，徐中友，邓明文，张健，
申请(专利权)人：上海科华生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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