【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物诊断试剂领域，具体涉及一种磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒及其制备方法和用途。
技术介绍
1、hbsag存在于乙型肝炎病毒(hepatitis b virus，hbv)颗粒的外壳以及小球形颗粒和管状颗粒中，hbsag蛋白的分子量为24千道尔顿左右。hbsag主蛋白由226个氨基酸组成。hbsag本身不具有传染性，但在病毒感染肝细胞过程中起重要作用。人感染hbv后4～7天，血清中出现hbsag，且常伴有hbv存在，因此，可作为hbv感染的标志物。在免疫耐受期、慢性乙型肝炎期(免疫清除期)、非活动携带状态期和再活动期，hbv感染以及部分肝硬化和肝癌患者的血清中均可检测到hbsag。此外，在hbv感染的潜伏期后期、急性期也可检测到hbsag。
2、在酶促化学发光检测平台上，一般采用直接标记的双抗体夹心法检测hbsag，其具体方式是将捕获抗体连接于磁珠上，将标记抗体连接于酶上，常用的酶有hrp、alp等，其具体检测的过程是：样本、抗-hbs包被的磁珠以及酶标记的抗-hbs混合后，孵育，洗涤。若样本中含有hbsag，便会被抗体捕获，形成磁珠-抗体、抗原、抗体-酶夹心复合物。通过磁吸、分离后，加入激发液或发光底物，产生的化学发光信号，通过发光信号判断样本中hbsag的含量，达到检测hbsag的目的。
3、现有技术检测hbsag的方法主要存在以下缺点：由于酶类分子量为110kd或44kd，分子量与抗体分子量相当，体积比较大，与抗体共价结合后空间位阻大，会影响标记抗体与hbsag的结合，影响试剂的灵敏
4、因此，本领域亟需一种新的检测hbsag化学发光试剂盒，以提高试剂的灵敏度。
技术实现思路
1、为克服现有技术缺陷，本专利技术采用了以下技术方案：
2、本专利技术的第一方面提供了一种磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒，包括：抗体-磁微粒制成的试剂r1，生物素标记-羊多抗制成的试剂r2，中性亲和素-碱性磷酸酶制成的试剂r3，以及阳性样本稀释而成的定标品；
3、进一步的，所述抗体-磁微粒制成的试剂r1包括以下步骤：
4、s1：用浓度为0.05～0.2mol/l、ph值为9.45～9.55的硼酸溶液清洗甲苯磺酰基磁微粒，然后加入hbs单抗，在35～40℃温度下旋转反应16～24小时，使得抗-hbs单抗包被甲苯磺酰基磁微粒，再用r1缓冲液清洗、封闭并保存hbsag捕获抗体-磁微粒，使hbsag捕获抗体-磁微粒浓度为8～12mg/ml，然后用r1缓冲液把hbsag捕获抗体-磁微粒稀释到0.1～0.2mg/ml，作为试剂r1；其中，所述甲苯磺酰基磁微粒平均粒径为1-3μm，hbs单抗：甲苯磺酰基磁微粒交联质量比为20～40μg：1mg，根据hbsag捕获抗体-磁微粒浓度、交联的甲苯磺酰基磁微粒质量和交联比计算加入的hbs单抗质量以及硼酸溶液的体积；更进一步的，所述r1缓冲液为含0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.1～1.0wt‰的表面活性剂、0.5～2wt‰proclin300的浓度为0.01～0.03mol/l、ph值为7.15～7.25的磷酸盐缓冲液；优选的，所述r1缓冲液为含1wt％的牛血清白蛋白、0.5wt‰的表面活性剂、1wt‰proclin 300的浓度为0.02mol/l、ph值为7.15～7.25的磷酸盐缓冲液；
5、进一步的，所述生物素标记-羊多抗制成的试剂r2的制备方法包括以下步骤：
6、s2：将识别hbsag多个位点的羊多抗储存溶液置换成磷酸盐缓冲液后，加入生物素溶液，其中，识别hbsag的多个位点羊多抗与生物素摩尔比为1:8～12，在室温下反应40～80min，反应结束后，除去未反应的生物素，得到生物素标记的羊多抗；优选的，所述识别hbsag的多个位点羊多抗与生物素摩尔比为1:10；
7、s3：用r2缓冲液将上述生物素标记的羊多抗稀释到3～10μg/ml，即得生物素标记-羊多抗制成的试剂r2；进一步的，所述r2缓冲液为含有3～6wt％牛血清白蛋白、0.1～1.0wt％酪蛋白、0.05～2wt％吐温20和0.01～0.03wt％的叠氮钠，且浓度为0.05～0.2mol/l、ph值为7～8的三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液；
8、进一步的，所述中性亲和素-碱性磷酸酶的制备方法包括包括以下步骤：
9、s4中性亲和素活化：称取一定量的中性亲和素，用不含氨基的缓冲液溶解，按照中性亲和素：2-亚氨基硫烷(2-it)摩尔比1：5～200添加2-it溶液，室温反应10～120min，去除未反应的2-it，获得活化中性亲和素
10、s5：将碱性磷酸酶(alp)和琥珀酰亚胺-dpeg-马来酰亚胺(sm(peg)12)按照摩尔比1：5～200混合，室温反应10～120min，去除未反应的sm(peg)12，获得活化碱性磷酸酶；
11、s6：将活化中性亲和素：活化碱性磷酸酶按摩尔比1:5～5:1混合，0～10℃下反应过夜，获得偶联后的中性亲和素与活化碱性磷酸酶；
12、s7：取一定量的n-乙基顺丁烯二酰亚胺(nem)，用不含氨基的缓冲液稀释至50～200mm，然后按照与2-it相同的摩尔量将nem溶液加入偶联后的中性亲和素与活化碱性磷酸酶，于室温反应5～20min，然后除未反应的nem，纯化后即得到na-ap,测试na-ap浓度，再用r3缓冲液将na-ap稀释到0.5～2μg/ml，作为试剂r3；
13、进一步的，所述不含氨基的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的任意一种或几种；
14、进一步的，所述r3缓冲液为含有0.005～0.02mol/l的氯化镁、0.05～0.2mmol/l的氯化锌、8～12wt％牛血清、0.2～1.0wt％明胶、0.05～0.2wt％吐温20以及0.01～0.03wt％叠氮钠，且浓度为0.05～0.2mol/l、ph值7～8的三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液；
15、进一步的，所述hbsag定标品的制备方法包括以下步骤：把hbsag阳性样本用定标品稀释液稀释成浓度为0.3～0.6iu/ml，分装，放在2～8℃下保存；更进一步的，所述定标品稀释液为含有1～3wt％牛血清白蛋白、15～30wt％丙三醇、0.01～0.03wt％叠氮钠，且浓度为0.05～0.2mol/l、ph值7～8的磷酸盐缓冲液；
16、本专利技术的第二方面提供了一种磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒的制备方法，包括以下步骤：将所述试剂r1、试剂r2、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，包括：抗体-磁微粒制成的试剂R1，生物素标记-羊多抗制成的试剂R2，中性亲和素-碱性磷酸酶制成的试剂R3，以及阳性样本稀释而成的定标品。
2.根据权利要求1所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述抗体-磁微粒制成的试剂R1包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述R1缓冲液为含0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.1～1.0wt‰的表面活性剂、0.5～2wt‰ProClin 300的浓度为0.01～0.03mol/L、pH值为7.15～7.25的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记-羊多抗制成的试剂R2的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述R2缓冲液为含有3～6wt％牛血清白蛋白、0.1～1.0wt％酪蛋白、0.05～2wt％吐温20和0.01～0.03wt％的叠氮钠，且浓度为0.05～0.2
6.根据权利要求1所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述中性亲和素-碱性磷酸酶的制备方法包括包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述不含氨基的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的任意一种或几种。
8.根据权利要求6所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述R3缓冲液为含有0.005～0.02mol/L的氯化镁、0.05～0.2mmol/L的氯化锌、8～12wt％牛血清、0.2～1.0wt％明胶、0.05～0.2wt％吐温20以及0.01～0.03wt％叠氮钠，且浓度为0.05～0.2mol/L、pH值7～8的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。
9.根据权利要求6所述磁微粒检测HBsAg化学发光试剂盒，其特征在于，所述HBsAg定标品的制备方法包括以下步骤：把HBsAg阳性样本用定标品稀释液稀释成浓度为0.3～0.6IU/mL，分装，放在2～8℃下保存；更进一步的，所述定标品稀释液为含有1～3wt％牛血清白蛋白、15～30wt％丙三醇、0.01～0.03wt％叠氮钠，且浓度为0.05～0.2mol/L、pH值7～8的磷酸盐缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒，其特征在于，包括：抗体-磁微粒制成的试剂r1，生物素标记-羊多抗制成的试剂r2，中性亲和素-碱性磷酸酶制成的试剂r3，以及阳性样本稀释而成的定标品。
2.根据权利要求1所述磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒，其特征在于，所述抗体-磁微粒制成的试剂r1包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒，其特征在于，所述r1缓冲液为含0.5～5wt％的牛血清白蛋白、0.1～1.0wt‰的表面活性剂、0.5～2wt‰proclin 300的浓度为0.01～0.03mol/l、ph值为7.15～7.25的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒，其特征在于，所述生物素标记-羊多抗制成的试剂r2的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述磁微粒检测hbsag化学发光试剂盒，其特征在于，所述r2缓冲液为含有3～6wt％牛血清白蛋白、0.1～1.0wt％酪蛋白、0.05～2wt％吐温20和0.01～0.03wt％的叠氮钠，且浓度为0.05～0.2mol/l、ph值为7～8的三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液。
6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：施维，沈丹，胡百敏，
申请(专利权)人：上海科华生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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