细胞培养方法技术

本发明专利技术提供一种培养方法，可长期培养器官的类器官并使之成熟，适用于制备立体器官。本发明专利技术的培养方法是对被固定化在腔室内的器官的类器官及/或构成器官的细胞一边灌注培养液一边进行培养的方法，其中，上述培养液以在上述腔室内产生湍流的方式被灌注。述腔室内产生湍流的方式被灌注。述腔室内产生湍流的方式被灌注。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞培养方法


[0001]本专利技术涉及器官的类器官(organ organoid)及/或构成器官的细胞的培养方法。更详细而言，本专利技术涉及对器官的类器官及/或构成器官的细胞一边灌注培养液一边进行培养的方法。

技术介绍

[0002]以针对肝脏、肾脏等各种器官的疾病的医药品开发、再生医疗的实现为目标，正在进行使培养细胞自组装而制造出重现各器官的三维结构、血管、胆管、其他脉管的复杂结构的细胞结构体、即器官的类器官为目的的研究开发。作为这样的器官的类器官的发展性细胞结构体，将包含未分化细胞的特定种类的细胞组合进行培养，从而能够制备在发育初期所形成的器官的原基、即器官芽(例如肝脏的器官芽、即肝芽)。这样也被称为“迷你器官”的类器官，与现有的单独培养的器官的细胞等相比，除了可以用作药效或毒性的评价更接近于生物体的评价系统外，也可用于移植手术、血浆蛋白质的产生等，利用价值极高。
[0003]一般而言，各种器官的类器官是通过在培养液(液体培养基)为静止的环境下的培养(静态培养)而制备的，不过，也提出了在灌注培养液的环境下的培养(灌注培养)。例如，在非专利文献1中，记载了：通过对肾脏类器官进行灌注培养，肾小球的血管变得发达等。另外，在非专利文献2中，记载了：使用微流体装置，将生物组织切片(脑组织的视交叉上核(SCN))静置于培养液渗透膜上，并控制培养液的灌注速度来将覆盖组织的液体保持在适当的量，从而保持营养供给与呼吸的平衡，同时进行长期培养等。在非专利文献3中，记载通过将肺上皮细胞以气液界面(ALI)灌注培养，能够比静态培养更为促进细胞的成长及分化等。需要说明的是，在这样的器官的类器官、组织等的灌注培养中，一般而言，使培养液以一定的速度灌注并形成“层流”，并且以尽可能不对器官的类器官、组织等施加剪切应力的方式进行。
[0004]现有技术文献
[0005]非专利文献
[0006]非专利文献1：Homan,K.A.等，Flow
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enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.Nat Methods 16,255
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262(2019)doi:10.1038/s41592
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019
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0325
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[0007]非专利文献2：Ota,N.等，A Microfluidic Platform Based on Robust Gas and Liquid Exchange for Long term Culturing of Explanted Tissues.Analytical Sciences,Oct 2019,Vol.35
[0008]非专利文献3：Long term Culturing of Explanted Tissues.Analytical Sciences,Oct 2019,Vol.35

技术实现思路

[0009]专利技术所要解决的问题
[0010]根据现有通常的静态培养，并不容易将通过长时间的培养而成熟的器官的类器官进一步制备成立体器官。例如，可发现如下问题：如果在静态培养中对肝脏类器官进行长时间培养，则难以维持成熟的肝细胞，经过约2周的培养而发生细胞死亡，细胞密度降低，在细胞间产生空隙。
[0011]本专利技术的课题在于提供一种培养方法，可对器官的类器官进行长时间培养并使其成熟，适用于制备立体器官。
[0012]用于解决问题的方案
[0013]本申请专利技术人发现：通过间歇地使灌注的培养液(液体培养基)的流量上升，即间歇地使腔室内的培养液的流速上升，对器官的类器官及/或构成器官的细胞施加暂时性的过渡状态的“湍流”，从而能够制备由已成熟的细胞所构成的、更高密度的器官的类器官或立体器官，从而完成了本专利技术。
[0014]即，本专利技术为了解决上述课题，提供以下的[1]～[15]。
[0015][1][0016]一种培养方法，是对被固定化在腔室内的器官的类器官及/或构成器官的细胞一边灌注培养液一边进行培养的方法，
[0017]其中，上述培养液以在上述腔室内产生湍流的方式被灌注。
[0018][2][0019]根据项1所述的培养方法，其中，上述培养液以分别包含在上述腔室内从层流向湍流转移的时间、产生湍流的时间、从湍流向层流转移的时间的方式被灌注。
[0020][3][0021]根据项1或2所述的培养方法，其中，上述器官的类器官及/或构成器官的细胞以被包埋于基质中的状态进行了固定化。
[0022][4][0023]根据项1～3中任一项所述的培养方法，其中，包埋有上述器官的类器官及/或构成器官的细胞的基质以被悬挂于通气性膜的状态而固定化在腔室内。
[0024][5][0025]根据项1～4中任一项所述的培养方法，其中，上述器官的类器官具有脉管结构，及/或上述构成器官的细胞与脉管细胞共存。
[0026][6][0027]根据项1～5中任一项所述的培养方法，其中，上述器官的类器官为肝类器官或肾类器官，及/或上述器官为肝脏或肾脏。
[0028][6a][0029]根据项1～5中任一项所述的培养方法，其中，上述器官的类器官为肝脏、肾脏、胰脏、甲状腺、甲状旁腺、肺、脑或心脏的类器官。
[0030][7][0031]一种立体器官的制造方法，其包括实施项1～6中任一项所述的培养方法的步骤。
[0032][8][0033]根据项1～6中任一项所述的培养方法，其中，上述培养液含有药物。
[0034][9][0035]根据项8所述的培养方法，其中，上述药物用于治疗伴随缺血的疾病。
[0036][9a][0037]根据项8所述的培养方法，其中，上述药物用于治疗缺血性疾病、梗塞〃坏死性疾病或出血性疾病。
[0038][9b][0039]根据项8所述的培养方法，其中，上述药物用于评价伴随缺血或出血的副作用涉及的安全性。
[0040][10][0041]一种药效评价方法，其包括实施项8或9所述的培养方法的步骤。
[0042][10a][0043]一种药物评价方法，其包括实施项8、9、9a或9b所述的培养方法的步骤、及评价上述药物对于上述器官的类器官的有效性及/或安全性的步骤。
[0044][11][0045]一种器官的类器官，其是通过项1～6中任一项的培养方法得到的。
[0046][12][0047]一种立体器官，其是通过项7所述的制造方法得到的。
[0048][13][0049]一种药效评价方法，其包括在项12所述的立体器官的培养基中添加药物的步骤、及评价上述药物对于上述立体器官的药效的步骤。
[0050][13a][0051]一种药物评价方法，其包括在项12所述的立体器官的培养基中添加药物的步骤、及评价上述药物对于上述立体器官的有效性及/或安全性的步骤。
[0052][14]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种培养方法，其是对被固定化在腔室内的器官的类器官及/或构成器官的细胞一边灌注培养液一边进行培养的方法，其中，所述培养液以在所述腔室内产生湍流的方式被灌注。2.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述培养液以分别包含在所述腔室内从层流向湍流转移的时间、产生湍流的时间、从湍流向层流转移的时间的方式被灌注。3.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述器官的类器官及/或构成器官的细胞以被包埋于基质中的状态进行了固定化。4.根据权利要求1所述的培养方法，其中，包埋有所述器官的类器官及/或构成器官的细胞的基质以被悬挂于通气性膜的状态而固定化在腔室内。5.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述器官的类器官具有脉管结构，及/或所述构成器官的细胞与脉管细胞共存。6.根据权利要求1所述的培养方法，其中，所述器官的类器官为肝类器官或肾类器官，及/或所述器官为肝脏或肾脏。7.一种立体器官的制造方法，其包括实施权利要求1～6中任一项所述的培养方法的步骤。8.根据权利要求1～6中任一项所述的培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：武部贵则，佐伯宪和，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：