一种适用于单细胞测序的肝组织样本制备方法技术

本发明专利技术首次创新公开了一种用于单细胞测序的肝组织样本制备方法，包括离体肝组织灌注处理和单细胞悬液制备方法。本发明专利技术还公开用于前述方法中的试剂盒。本发明专利技术弥补了以往实验方法造成的某些细胞类型的细胞数过少或丢失的缺点。本发明专利技术还公开了所述的方法在单细胞测序、单细胞悬液制备、肝脏原代细胞解离中的应用。用。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于单细胞测序的肝组织样本制备方法


[0001]本专利技术涉及单细胞测序
，特别是涉及一种适用于离体肝组织样本保存的用于单细胞测序的技术方法。

技术介绍

[0002]单细胞或单细胞核测序技术在临床与科研领域中的应用越来越广泛，可以实现在单细胞水平上开展对生长与发育、疾病发生、肿瘤形成与发展、肿瘤微环境、基因编辑或基因治疗等方面的研究。单细胞测序，首先要制备高质量的单细胞悬液。常见的单细胞悬液制备方法有：机械法、匀浆法、酶解消化法等，其中，酶解消化法适用于大多数动物器官或组织来源的样本。
[0003]肝脏是人体发挥代谢与免疫功能的重要器官。因此，无论从临床还是科研角度，对人或动物肝脏或肝癌组织进行单细胞测序，以获得丰富的单细胞水平的基因表达数据信息，对于了解肝脏疾病或肿瘤的发生发展、开发相关的治疗或预防药物等，都具有重要指导意义。然而，由于肝脏的基本结构单位(肝小叶)组成复杂，占肝脏细胞总量70％左右的肝实质细胞由两侧肝窦内皮细胞包裹形成三明治结构，肝实质细胞内部还有大量管状结构(血管、胆管等)贯穿。并且，肝脏属于代谢旺盛的器官，离体后发挥肝功能作用的肝实质细胞无法再进行有氧糖酵解，其活力会迅速下降，因此，离体肝组织经机械法或酶解消化后所获得的单细胞测序数据中，细胞类型主要为非实质细胞(NPC)和免疫细胞，而肝实质细胞占比较小，有时甚至由于过少而无法进行下游的数据分析。并且，死亡的肝实质细胞破裂还会造成单细胞悬液中较高的碎片率，进而影响其他正常活细胞的捕获效率和最终的数据质量。
[0004]与单细胞测序相比，细胞核测序可以从液氮速冻的冻存组织中直接抽提细胞核制备成单细胞核悬液用于后续的测序和分析，肝脏组织的单细胞核测序可以获得大量的肝实质细胞，然而，由于肝实质细胞在肝脏组织中占比很高(约70％)，导致肝组织的单细胞核测序数据中肝实质细胞占比过高，而免疫细胞和非实质细胞占比过少，同样对研究者开展更深入的研究(比如免疫微环境等)造成很大障碍，无法满足研究者的实验和数据需求。
[0005]目前，使用最广泛的单细胞测序平台是10
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Genomics和BD平台，都需要借助较为昂贵的设备和试剂，并且需要实验人员具备比较丰富的实验经验才能确保实验成功，因此单细胞测序样本的单细胞制备、文库构建、高通量测序等实验在很大程度上还是依赖于技术服务公司。然而，从新鲜样本采集后放入组织保护液中，到低温(0
‑
4℃)条件下寄送至服务公司一般需要24～36小时，有时甚至更长。对于比较脆弱的肝组织(尤其是肝实质细胞)来说，过长的离体运输时间会导致细胞活率的极大下降以及大比例实质细胞的凋亡或死亡。
[0006]为此，急需一种适用于单细胞测序并且能够同时获得更丰富、更全面的细胞类型的离体肝组织样本的制备方法。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种操作相对简单，并且能够一次性获得肝实质细胞、非实质细胞以及免疫细胞等多种细胞类型用于单细胞测序的肝组织处理和解离方法。
[0008]本专利技术提供了一种用于单细胞测序的肝组织样本制备方法，具体包括以下步骤：
[0009]一、离体肝组织灌注处理
[0010]将肝组织清洗，灌注灌洗液I得到灌洗物，备用；然后继续向肝组织中灌注灌洗液II，然后在培养基中静置，得到灌注好的肝组织块；
[0011]步骤(一)中，所述灌洗液I为不含钙、镁离子的HBSS溶液。
[0012]步骤(一)中，所述灌注灌洗液I得到灌洗物的具体步骤为：用无菌注射器将4℃预冷的灌洗液I按照从肝组织块中央到四周的顺序均匀地灌注到多个不同部位，灌注的部位为中央静脉和门静脉等血管或血管周围，灌注时注射器应垂直于组织表面。每个位置至少灌注2次，每次200
‑
500μl灌洗液I，移弃开始灌洗流出的肉眼可见红色的残留血液(根据组织大小，约1
‑
4ml)，继续灌注每个位置2
‑
3次，并收集流出的无肉眼可见红色的灌洗物，停止灌注。
[0013]本专利技术中，一般0.5mm3大小或者100mg左右的组织块，灌洗液I的总用量为2.0
‑
4.0ml。本专利技术根据组织块的大小，等比例增加灌洗液I的体积。
[0014]步骤(一)中，所述灌注灌洗液I得到的灌洗物是指从无肉眼可见红色的灌洗物开始收集至灌洗液I灌注结束时，从肝组织中流出的灌洗物。
[0015]步骤(一)中，所述灌洗液II的组分及含量为：0.5
‑
2ml灌洗液I、3～8％海藻糖、5～10mg/mL Matrigel基质胶。
[0016]步骤(一)中，所述灌注灌洗液II的具体步骤为：用预冷的无菌注射器将预冷的灌洗液II按照与灌洗液I同样的灌注部位和相似的灌注方式(中央静脉和门静脉等血管或血管周围)，垂直地、均匀地灌注到肝组织的不同部位，每个部位灌注1
‑
2次，每次100μl。
[0017]本专利技术中，一般0.5mm3大小或者100mg左右的组织块，灌洗液II的用量为0.5
‑
1.0ml。本专利技术根据组织块的大小，等比例增加灌洗液II的体积。
[0018]本专利技术中，所述灌洗液I与灌洗液II的用量约为4:1。
[0019]步骤(一)中，所述静置的温度为22
‑
35℃；所述静置的时间为5
‑
10min。
[0020]二、单细胞悬液制备方法
[0021]1.灌洗物单细胞悬液制备：
[0022]将前述步骤(一)制备的灌洗物进行第一次离心收集细胞；加入培养基重悬后再加入红细胞裂解液，室温静置；然后第二次离心收集细胞，待无红细胞残留后，加入培养基重悬，即得灌洗物单细胞悬液；
[0023]所述第一次离心的条件为：4℃500g离心5
‑
10min；
[0024]所述室温静置的时间为3
‑
5min；
[0025]所述第二次离心的条件为：4℃500g离心5
‑
10min。
[0026]2.肝组织单细胞悬液制备：
[0027]将前述步骤(一)灌注好的肝组织块用DMEM培养基清洗、剪碎、酶解消化，过筛后进行第一次离心，然后重悬，得到单细胞悬液。
[0028]所述酶解的酶是指终浓度为0.1
‑
0.25％的胶原酶II、0.1
‑
0.25％胶原酶IV和20
‑
40U/ml DNaseI；
[0029]所述酶解消化的时间为30
‑
40min。
[0030]所述第一次离心的条件为4℃300
‑
500g离心5
‑
10min。
[0031]本专利技术还包括单细胞测序的步骤：将制备的灌洗物单细胞悬液与单细胞悬液合并，去碎片，然后离心洗涤，重悬，测序。
[0032]在一个具体实施方案本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于单细胞测序的肝组织样本制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(一)离体肝组织灌注处理将肝组织清洗，灌注灌洗液I得到灌洗物，备用；然后继续向肝组织中灌注灌洗液II，然后在培养基中静置，得到灌注好的肝组织块；(二)单细胞悬液制备方法灌洗物单细胞悬液制备：将前述步骤(一)制备的灌洗物进行第一次离心收集细胞；加入培养基重悬后再加入红细胞裂解液，室温静置；然后第二次离心收集细胞，待无红细胞残留后，加入培养基重悬，即得灌洗物单细胞悬液；肝组织单细胞悬液制备：将前述步骤(一)灌注好的肝组织块用DMEM培养基清洗、剪碎、酶解消化，过筛后进行第一次离心，然后重悬，得到单细胞悬液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(一)中，所述灌洗液I为不含钙、镁离子的HBSS溶液；所述灌洗液II的组分及含量为：0.5
‑
2ml所述灌洗液I、3～8％海藻糖、5～10mg/mLMatrigel基质胶。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(一)中，所述静置的温度为22
‑
35℃；所述静置的时间为5
‑
10min。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(二)中，所述灌洗物单细胞悬液制备中，所述第一次离心的条件为：4℃500g离心5
‑
10min；所述室温静置的时间为3
‑
5min；所述第二次离心的条件为：4℃500g离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翠亭，张志明，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：