一种高效转染细胞株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于细胞株筛选技术领域，公开了一种高效转染细胞株及其制备方法和应用。本发明专利技术的高效转染细胞株由荧光质粒转染和流式细胞仪分选循环交替进行筛选而得。本发明专利技术的制备方法所得的高效转染细胞株对质粒容忍性好，易于被转染，外源基因表达效率高。适用于高表达需求和病毒包装。求和病毒包装。求和病毒包装。

【技术实现步骤摘要】
一种高效转染细胞株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞株筛选
，具体涉及一种高效转染细胞株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]转染指在一定条件下，将外源DNA导入真核细胞的过程。常规的转染方法有磷酸钙转染、脂质体转染及电转染等。磷酸钙转染法是指形成一种DNA
‑
磷酸钙沉淀物，使其粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获。脂质体转染法是指阳离子脂质体表面带正电荷，能与DNA的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA
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脂复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合作用，DNA传递进入细胞。电转染法是通过电场作用于细胞之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入细胞核的技术。转染的应用领域包括研究基因功能、调控基因表达、突变分析、病毒包装和蛋白质生产等生物学试验，是细胞生物学研究中的常规工具。
[0003]HEK293细胞来源于人胚胎肾细胞(Human Embryonic Kidney，HEK)。在人胚胎肾细胞第19号染色体上整合入4.35kb的腺病毒基因组片段后，导致HEK293的出现。HEK293细胞已广泛应用于多个领域，成为生产蛋白质、疫苗、抗癌药物和重组腺病毒载体的强大载体和新平台。其优点包括：在使用最常见的转染试剂时HEK293细胞表现出了高于其他细胞的转染效率；HEK293细胞是用于制药生产的大规模悬浮培养的理想宿主细胞；HEK293细胞拥有人类所有的翻译后修饰，它们能够产生与人类自然合成的蛋白质最相似的蛋白质；HEK293细胞生长速度快，在摇瓶中细胞密度高，代谢高效灵活，是生物治疗生产的可行工具；同时HEK293细胞是一种敏感的人类胚胎细胞，具有与早期分化神经元相似的特征，在体外对环境因素敏感，常作为新药发现和毒性试验的模型。HEK293具有一些特性例如复杂的表型，不稳定的核型和肿瘤原性。在此基础上，人们又进行了许多改造，产生了许多衍生细胞系：293E细胞表达EBNA
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1,EBNA
‑
1能够促进游离DNA的核转移和增强子活性，从而促进蛋白质生产；293
‑
6E细胞是一个新的293E细胞系，表达截断型的EBNA
‑
1，可以在不含血清的条件下进行蛋白或病毒载体生产；293F细胞是一种在无血清培养基中生长迅速、蛋白表达量高的293细胞株，可根据细胞密度、培养基类型和转染试剂做DOE条件摸索出合适的转染条件；293F细胞经质粒pCMVSPORT6TAg的作用，获得293FT细胞，用于生产慢病毒载体，但需要配套的培养基和转染试剂；293S细胞适合在低钙离子浓度培养基中悬浮生长，同样需要特殊的培养基；293T细胞表达SV40T基因，许多真核表达载体含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T蛋白的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。
[0004]在实际的HEK 293转染实验中，高效的转染和表达效率跟转染试剂有关，也跟细胞本身的性质有关，而细胞本体却是错综复杂的，改造的方向可包括代谢、容忍性、增长率、免疫抵抗等。然而，目前通常使用的方法是测试更加配套的细胞培养基和转染试剂，该方法投入的研发成本较大，且研发出来后使用的成本也较高。虽然市面上的HEK293相关细胞的转染效率已经达到约80％，但是基于HEK 293的广泛应用，如何进一步有效地、低成本地提高
转染和表达效率仍是行业内难点之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种高效转染细胞株及其制备方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种高效转染细胞株，由荧光质粒转染和流式细胞仪分选循环交替进行筛选而得。
[0008]优选的，所述荧光质粒携带表达红色或绿色荧光的表达框。
[0009]本专利技术高效转染细胞株通过多次交替瞬转的方式而得，对质粒容忍性好，易于被转染，外源基因表达效率高，细胞转染效率比野生细胞高约2倍。当使用正常的用量进行病毒包装时，细胞平均滴度可达2.365E+11GC/mL，当将质粒和转染试剂用量减半，细胞平均滴度几乎没有变化。
[0010]作为本专利技术所述的高效转染细胞株的优选实施方式，所述交替进行筛选至少5～6轮；优选的，所述交替进行筛选共5～6轮。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种高效转染细胞株的制备方法，包括以下步骤：
[0012](1)配制转染混合物，所述转染混合物包括转染试剂和荧光质粒A；
[0013](2)将所述转染混合物加入所述待转染细胞；
[0014](3)重悬细胞，经流式细胞筛过滤；稀释细胞密度至105～107cells/mL，进行流式分选，将荧光强度最强的前5％～10％的细胞分选出来；
[0015](4)继续培养至细胞的荧光丢失，得转染细胞A；
[0016](5)重复步骤(1)和(2)将荧光质粒B转入所述转染细胞，重复步骤(3)和(4)，得转染细胞B；
[0017](6)按照步骤(1)～(5)进行质粒转染和流式分选循环交替共进行5～6轮，即成。
[0018]作为本专利技术所述的高效转染细胞株的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述转染试剂为氯化钙和磷酸盐缓冲液。
[0019]优选的，所述转染试剂为行业内常用转染试剂，包括但不限于磷酸钙、PEI、脂质体等；
[0020]优选的，所述细胞为293T细胞，所述普板的细胞数为4
×
106～5
×
106cells。
[0021]作为本专利技术所述的高效转染细胞株的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)和(5)中，所述荧光质粒A和荧光质粒B分别携带表达红色或绿色荧光的表达框。
[0022]优选的，在步骤(1)中，所述转染混合物为氯化钙、pUC19、pRP[Exp]‑
CMV>EGFP、磷酸盐缓冲液；按体积质量比计，所述氯化钙：pUC19：pRP[Exp]‑
CMV>EGFP：磷酸盐缓冲液＝1～2mL：4～5μg：0.5～1.5μg：1～2mL。
[0023]进一步的，所述氯化钙：pUC19：pRP[Exp]‑
CMV>EGFP：磷酸盐缓冲液＝1.5mL：6μg：1μg：1.5mL。
[0024]优选的，在步骤(5)中，所述荧光质粒B为pRP[Exp]‑
CMV>mCherry。
[0025]作为本专利技术所述的高效转染细胞株的制备方法的优选实施方式，在步骤(4)中，所述继续培养的时间为10～15天。
[0026]第三方面，本专利技术将所述的制备方法、所述的高效转染细胞株在质粒转染和/或病毒包装中应用。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0028]本专利技术基于最普通的转染试剂，通过多本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效转染细胞株，其特征在于，由荧光质粒转染和流式细胞仪分选循环交替进行筛选而得。2.根据权利要求1所述的高效转染细胞株，其特征在于，所述交替进行筛选至少5～6轮。3.一种权利要求1或2所述高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制转染混合物，所述转染混合物包括转染试剂和待转染质粒A；(2)将所述转染混合物加入待转染细胞；(3)重悬细胞，经流式细胞筛过滤；稀释细胞密度至105～107cells/mL，进行流式分选，将荧光强度最强的前5％～10％的细胞分选出来；(4)继续培养至细胞的荧光丢失，得转染细胞A；(5)重复步骤(1)和(2)将荧光质粒B转入所述转染细胞，重复步骤(3)和(4)，得转染细胞B；(6)按照步骤(1)～(5)进行质粒转染和流式分选循环交替共进行5～6轮，即成。4.根据权利要求2所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述细胞为293T细胞。5.根据权利要求2所述的高效转染细胞株的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述转染试剂为氯化钙和磷酸盐缓冲液。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：施金秀，蔡泽坡，蓝田，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州股份有限公司，
类型：发明
国别省市：