一种鲜乳中外泌体规模化提取方法技术

本发明专利技术公开了一种鲜乳中外泌体规模化提取方法，该方法将鲜乳用亲水疏脂的纳米界面网膜过滤除去鲜乳中细胞碎片及脂肪颗粒，再通过孔径100kDa～300kDa超滤膜的切向流超滤装置超滤对澄清的鲜乳进行浓缩；将浓缩液和聚乙二醇、葡聚糖组合配制的双水相溶液混合后进行相分离，收集下相中富集的外泌体溶液，重复1～2次对外泌体浓缩；再通过高度交联琼脂糖填料柱对浓缩的外泌体进一步分离除去其他的杂蛋白，分离出不同直径的外泌体、外囊泡。本发明专利技术纯化过程简单、无需高速离心、一次性可以处理几十升以上鲜乳，提取纯度高并能有效分离不同粒径的外囊泡，对外泌体损伤小，可以做到大规模的提取。提取。提取。

【技术实现步骤摘要】
一种鲜乳中外泌体规模化提取方法


[0001]本专利技术属于提取工艺
，具体涉及一种规模化提取鲜乳中外泌体的方法。

技术介绍

[0002]外泌体是一类由细胞释放的脂质双层膜的代谢产物，透射电镜下呈圆形或杯状，直径为30～150nm。大量研究表明，外泌体含有多种蛋白质、核酸、脂质等成分。从目前的研究中发现外泌体具有十分光明的应用前景，它含有丰富的标志物，可应用于疾病的监测、治疗等方面。而且不同组织、细胞来源的外泌体都有其来源组织、细胞的特性，在外泌体介导的细胞间物质、信息交流过程中发挥关键作用。同时外泌体在临床治疗、载体药物、临床检测等方面有广大的应用前景，肿瘤细胞外泌体中的蛋白、脂质、RNA、miRNA等组分可作为癌症诊断和预兆。
[0003]在目前研究的鲜乳中也发现大量的外泌体存在，已有研究表明，鲜乳外泌体有助于免疫调节，调节肠道的发育以及对一些疾病有所缓解。国内对于鲜乳外泌体研究主要集中在外泌体的提取和鉴定以及作为药物载体、疾病筛查标志物的研究上，国外对牛乳外泌体的研究更多一点不仅涉及到人体免疫系统、肠道发育、癌症预防、肥胖、糖尿病等慢性疾病发展带来的风险。最近鲜乳外泌体的研究越来越深入，作为一种产品，研究方向，功能性研究需求量也在增多，因此大量提取鲜乳外泌体的方法有待解决。
[0004]目前提取外泌体的技术有很多，主要有超速离心法、试剂盒法，蔗糖密度梯度离心法是最常用的外泌体提取纯化手段。这几种方法提取的数量有限，过程也比较费时，对设备要求高，回收率也有限，纯度也达不到要求。以上几种方法都不能解决大规模提取纯化的要求，限制了外泌体产业化的应用范围。
[0005]鲜乳中外泌体的分离提取方法文献报道的也不多，现有的各种提取方法也存在各种利弊，尤其是大规模提取方面少之又少，很难达到批量化生产。而且，鲜乳中乳脂肪以脂肪球的状态分散在乳浆中，一般直径为0.1～10μm，绝大数为2～5μm，影响外泌体提取的最大阻碍因素就是脂肪颗粒，它在鲜乳中的含量一般为3％～5％，且不溶于水，呈微球状分散于鲜乳中，形成乳浊液，不能通过普通的过滤去除。因此，寻找一种成本低廉、高效、适用性广的鲜乳外泌体规模化提取并同时能去除脂肪颗粒的方法显得尤为重要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对鲜乳外泌体提取技术存在的问题，提供一种大规模提取鲜乳中外泌体的方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用的鲜乳中外泌体规模化提取方法包括以下步骤：
[0008]1.将鲜乳用亲水疏脂的纳米界面网膜进行过滤，除去鲜乳中的脂肪颗粒，收集滤液。
[0009]2.将步骤1收集的滤液通过孔径100kDa～300kDa超滤膜的切向流超滤装置进行超滤，对除去脂肪颗粒的滤液进行浓缩。
[0010]3.将步骤2收集的浓缩鲜乳和双水相溶液充分混合后进行离心分离，弃上相，收集下相；下相重复该步骤1～2次，进一步浓缩外泌体溶液；所述双水相溶液是将聚乙二醇和葡聚糖溶解在蒸馏水或者PBS缓冲液中配制而成，双水相溶液中聚乙二醇的浓度为20～40g/L、葡聚糖的浓度为14～20g/L。
[0011]4.将步骤3中浓缩的外泌体溶液用稀释液稀释后经过凝胶柱进一步分离，所述凝胶柱采用高度交联琼脂糖作为填料，稀释液为含150mM NaCl的20mM pH＝7.2Tris
‑
HCl缓冲液。
[0012]上述步骤1中，所述鲜乳包括鲜牛奶、鲜羊奶、鲜人乳、骆驼乳中任意一种或多种。
[0013]上述步骤1中，所述亲水疏脂的纳米界面网膜的涂层为聚乙烯醇/二氧化硅纳米复合薄膜，该薄膜与水的接触角为00～250，与鲜乳中脂肪接触角为600～1300，可用来阻止鲜乳中的脂肪颗粒成分通过该膜。
[0014]上述步骤3中，优选将步骤2收集的浓缩鲜乳和双水相溶液按体积比为1:3～3:1充分混合后进行离心分离。
[0015]上述步骤3中，所述聚乙二醇的分子量5kDa～35kDa，葡聚糖的分子量7kDa～65kDa。
[0016]上述步骤3中，所述离心分离的离心力是1000～3000g，离心时间是10～40分钟。
[0017]上述步骤4中，所述高度交联琼脂糖的分子量为600kDa～800kDa，粒径为75～95μm。
[0018]本专利技术的有益效果如下：
[0019]1.本专利技术首先通过亲水疏脂的纳米界面网膜对鲜乳进行过滤，收集澄清液，除去鲜乳中的脂肪颗粒，解决了由于脂肪对纯化的影响；接着用孔径100kDa～300kDa超滤膜的切向流超滤装置超滤，进行第一次浓缩，除去部分小分子的蛋白和水分，澄清的鲜乳被浓缩了10～20倍；浓缩处理后的鲜乳澄清滤液用聚乙二醇和葡聚糖组合配制成的双水相溶液进行离心分离，进行第二次浓缩和初步纯化，外泌体被压缩到葡聚糖相，除去上相，此过程重复1～2次后，此时澄清的外泌体已被浓缩了60～150倍，使生产级别的量变成实验室级别的量，外泌体达到高度浓缩，使得使用凝胶柱分离成为可能；最后以高度交联琼脂糖为填料的凝胶柱分离去除其他的杂蛋白和凋亡小体，纯化出不同粒径大小的外泌体和细胞外囊泡，实现对鲜乳中外泌体的规模化提取。
[0020]2.本专利技术整个操作过程简单，避免了高速离心对提取规模的限制，适合大规模提取和浓缩，通过近百倍高度浓缩，克服了凝胶柱上样量有限的问题，解决了大规模提取的难度。整个实验过程没有引入变性能力较强的化学试剂和剧烈的反应，对外泌体的损伤较小，不需要超速离心机、免疫磁珠，可以做到工业化生产，无需复杂的过程，可以处理大量的不同来源的外泌体，提取的外泌体经过活性的鉴定、电镜检测、粒径分析、纳米颗粒示踪分析、蛋白含量检测等一系列鉴定验证，损伤率小，突变率小，性质稳定。
附图说明
[0021]图1是鲜牛奶除去脂肪颗粒前(a)以及采亲水疏脂的纳米界面网膜除去脂肪颗粒后(b)和采用化学试剂沉淀法除去脂肪颗粒后(c)的显微镜观察图片。
[0022]图2是实施例1中切向流超滤装置超滤浓缩后进行的粒径分析(NTA)验证所得到的
颗粒粒径分布图。
[0023]图3是实施例1中双水相溶液提取的外泌体进行粒径分析(NTA)验证所得到的颗粒粒径分布图片。
[0024]图4是实施例1中凝胶柱提取的外泌体的透射电镜(TEM)验证图片。
[0025]图5是实施例1中凝胶柱提取的外泌体进行粒径分析(NTA)验证所得到的颗粒粒径分布图片。
[0026]图6是实施例1中高度交联琼脂糖凝胶柱分离后不同大小囊泡的分布图。
[0027]图7是图6中峰1和峰2物质使用外泌体蛋白标志物CD63进行验证图(western blot)。
具体实施方式
[0028]首先，本专利技术以新鲜牛奶为例，比较亲水疏脂的纳米界面网膜(涂层为聚乙烯醇/二氧化硅复合薄膜)分离除去脂肪颗粒和化学试剂沉淀去除脂肪颗粒的效果。具体实验为：取1000mL新鲜牛奶通过以聚乙烯醇/二氧化硅复合薄膜为涂层的亲水疏脂的纳米界面网膜进行过滤，去除鲜牛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲜乳中外泌体规模化提取方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：(1)将鲜乳用亲水疏脂的纳米界面网膜进行过滤，除去鲜乳中的脂肪颗粒，收集滤液；(2)将步骤(1)收集的滤液通过孔径100kDa～300kDa超滤膜的切向流超滤装置进行超滤，对除去脂肪颗粒的滤液进行浓缩；(3)将步骤(2)收集的浓缩鲜乳和双水相溶液充分混合后进行离心分离，弃上相，收集下相；下相重复该步骤1～2次，进一步浓缩外泌体溶液；所述双水相溶液是将聚乙二醇和葡聚糖溶解在蒸馏水或者PBS缓冲液中配制而成，双水相溶液中聚乙二醇的浓度为20～40g/L、葡聚糖的浓度为14～20g/L；(4)将步骤(3)中浓缩的外泌体溶液用稀释液稀释后经过凝胶柱进一步分离，所述凝胶柱采用高度交联琼脂糖作为填料，稀释液为含150mM NaCl的20mM pH＝7.2Tris
‑
HCl缓冲液。2.根据权利要求1所述的鲜乳中外泌体规模化提取方法，其特征在于，步骤(1)中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王鑫，王瑞莉，翟江华，邓晗，程南琼，罗琳娜，李元，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：