一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及医学分析检测技术领域，尤其涉及一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法。本发明专利技术利用Trinder反应，在R1试剂中同时添加丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶，使反应中生成的H2O2大大提高，相对于传统方法，色原物质生成速度大于传统方法中NADH的消耗速度，从而使得灵敏度增加。高灵敏度不仅可以提高被测物的检出限，降低仪器的噪声对检测的影响，提高精密度，而且可以为以后降低样本使用量，提高临床样本的使用效率。临床样本的使用效率。

【技术实现步骤摘要】
一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及医学分析检测
，尤其涉及一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]ALT是转氨酶的一种，催化丙氨酸和α
‑
酮酸之间的氨基转移反应。磷酸吡哆醛是转氨酶的辅基，酶蛋白与磷酸吡哆醛结合后才具有催化活性。ALT是最最常见的临床检验项目之一。ALT主要存在于肝脏，但也广泛存在于心脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、肺等组织，这些组织损伤或者坏死是，血清中ALT升高。ALT主要存在于细胞质，释放容易，故血清ALT升高可出现于组织损伤早期。
[0003]测定血清ALT大多测定其催化活性。1955年Karmen建立基于酶偶联反应的紫外分光光度动态监测法(速率法)。1957年基于二硝基苯肼显色反应的比色法(赖氏法)。在早期技术条件下，赖氏比色法相对简单，曾得到广泛的应用，但该方法存在原理缺陷，也不便自动分析，后随着技术发展逐渐淘汰，速率法成为主流方法。20试剂70年代到80年代国际临床化学联合会(IFCC)对速率法反应条件(底物浓度，缓冲液种类，预温育，磷酸吡哆醛活化等)进行优化，推荐反应温度为30℃的ALT测定方法。该方法产生明显国际影响，目前的ALT测定方法几乎均源于此法，同时该方法在推进ALT测定标准化方面起到了一定的作用。在20世纪末人民发现该方法所能实现的标准化程度有限，遂考虑采纳计量学溯源原料。2002年，IFCC在原推荐方法的基础上提出ALT参考方法，仅为了适应现代检测仪器条件，将反应温度由30℃调整至37℃。该方法目前为国际公认的参考方法。目前也常使用可溯源至参考方法的定标品校准，以实现ALT测定标准化。
[0004]IFCC推荐的ALT测定参考方法原理为：血清ALT催化L
‑
丙氨酸与α
‑
酮戊二酸的氨基转移反应，生成丙酮酸和L
‑
谷氨酸。生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下氧化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，NADH在340nm波长处有较强光吸收，而NAD+无吸收，在底物过剩的情况下，丙酮酸的生成速率与血清ALT成正比，NADH下降速率与丙酮酸的生成速率成正比，因而可通过检测检测NADH下降速率测定血清ALT活性浓度。其酶偶联反应式如下：
[0005][0006][0007]IFCC方法作为推荐方法获得了市场大部分医学实验室和企业的认可。后续的各企业根据自身的情况，对试剂进行优化调整，大部分的改进均基于改良NADH的保存条件，降低NADH长期保存的成本，提高稳定性。
[0008]目前在干化学法试剂盒利用丙酮酸氧化酶，将ALT催化生成的丙酮酸用丙酮酸氧化酶催化生成过氧化氢，再通过检测过氧化氢的生成量检测ALT含量：丙氨酸氨基转移酶催化L
‑
丙氨酸的氨基转移到α
‑
酮戊二酸，以产生丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸被丙酮酸氧化酶氧化成乙酰磷酸酯和过氧化氢。过氧化氢在过氧化物酶的催化作用下使显色层中的4
‑
氨基安
替比林和N
‑
乙基
‑
N
‑
(2
‑
羟基
‑3‑
磺丙基)
‑
3,5
‑
二甲氧基苯胺钠氧化为蓝色醌型化合物，在590nm波长下，经反射分光光度法测量一定时间内反射率的变化率，通过标准曲线计算丙氨酸氨基转移酶的活性。将反应温度控制在37℃
±
1℃条件下，测定在5分钟内即可完成。该原理试剂也可改造为液体试剂，对试剂进行精确定量。宁波美康生物公司开发了一种利用丙氨酸底物
‑
丙氨酸氧化酶法，将ALT催化生成的丙酮酸用丙酮酸氧化酶催化生成过氧化氢，后者在过氧化物酶的催化与4
‑
氨基安替比林和色原反应，生成醌亚胺色素，使用分光光度计在对应波长下进行测定。这种方法绕过了NADH的保存问题，提高了试剂的稳定性。但该方法灵敏度仍然不够理想，存在较高的提升空间。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术提供了一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒及检测方法。与传统试剂盒相比，该试剂盒灵敏度高、精密度好，同时降低了样本使用量，大大提高了临床样本的使用效率。
[0010]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0011]一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒，由R1试剂和R2试剂组成；
[0012]所述R1试剂包括缓冲液、L
‑
丙氨酸、MgCl2、海藻糖、表面活性剂、防腐剂、酶保护剂、FAD、Vc氧化酶、磷酸二氢钾、色原物质、丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶；
[0013]所述R2试剂包括缓冲液、α
‑
酮戊二酸、酶保护剂、4
‑
AAP、过氧化物酶和防腐剂。
[0014]本专利技术采用酶偶联法，丙氨酸与α
‑
酮戊二酸在丙氨酸氨基转移酶(以下简称ALT)的催化下反应生成丙酮酸和谷氨酸。丙酮酸和谷氨酸分别在丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶的催化下与氧气反应生成过氧化氢，过氧化氢与色原在过氧化物酶的作用下产生醌亚胺色素，在对应的检测波长下检测吸光度的上升速率，与标准物质的上升速率比对，从而实现对ALT的定量检测。
[0015]一些实施方案中，所述R1试剂包括如下组下浓度的组分：
[0016][0017]一些实施方案中，所述R2试剂包括如下浓度的组分：
[0018][0019]一些实施方案中，所述R1试剂和R2试剂中，缓冲液为Tris缓冲液、Good
’
s缓冲液、磷酸盐缓冲液中的至少一种。
[0020]一些实施方案中，所述R1试剂中，表面活性剂为曲拉通、吐温、聚氧乙烯月桂醚，Thexit中的至少一种。
[0021]一些实施方案中，所述R1试剂和R2试剂中，酶保护剂为明胶、BSA中的一种或两种。
[0022]一些实施方案中，所述R1试剂中，色原为于N
‑
乙基
‑
N
‑
(2
‑
羟基
‑3‑
磺丙基l)
‑3‑
甲氧基苯胺钠盐(二水合物)(ADOS)、N
‑
乙基
‑
N
‑
(3
‑
磺丙基)
‑3‑
甲氧基苯胺钠盐(ADPS)、N
‑
乙基
‑
N
‑
(3
‑
磺丙基)苯胺钠盐(ALPS)、3
‑
羟基
‑
2,4,6
‑
三碘苯甲酸(HTBA)、N
‑
乙基
‑
N
‑
(3
‑
磺丙基)
‑3‑
甲基苯胺钠盐(TOPS)、N
‑
(2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种丙氨酸氨基转移酶的检测试剂盒，其特征在于，由R1试剂和R2试剂组成；所述R1试剂包括缓冲液、L
‑
丙氨酸、MgCl2、海藻糖、表面活性剂、防腐剂、酶保护剂、FAD、Vc氧化酶、磷酸二氢钾、色原物质、丙酮酸氧化酶和谷氨酸氧化酶；所述R2试剂包括缓冲液、α
‑
酮戊二酸、酶保护剂、4
‑
AAP、过氧化物酶和防腐剂。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂包括如下组下浓度的组分：3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂包括如下浓度的组分：4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂和R2试剂中，缓冲液为Tris缓冲液、Good
’
s缓冲液、磷酸盐缓冲液中的至少一种。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，表面活性剂为曲拉通、吐温、聚氧乙烯月桂醚，Thexit中的至少一种。6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1和R2试剂中，酶保护剂为明胶、BSA中的一种或两种。7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，色原为N
‑
乙基
‑
N
‑
(2
‑
羟基
‑3‑
磺丙基l)
‑3‑
甲氧基苯胺钠盐(二水合物)、N
‑
乙基
‑
N
‑
(3
‑
磺丙基)
‑3‑
甲氧基苯胺钠盐、N

【专利技术属性】
技术研发人员：王飞鹏，
申请(专利权)人：北京安图生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：