D-二聚体检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及医学检测技术领域，具体涉及D

【技术实现步骤摘要】
D
‑
二聚体检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及医学检测
，具体涉及D
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二聚体检测试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]D
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二聚体(D
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dimer,DD)是交联纤维蛋白在纤维酶作用下所产生的一种特异性纤维蛋白降解产物。在血液凝固过程中，纤维蛋白原被水解为可溶性的纤维蛋白单体，纤维蛋白单体自动聚合成网状多聚体，在凝血酶和因子Factor XIIIa的作用下单体之间共价交联形成交联纤维蛋白。与此同时，体内交联纤维蛋白被纤溶酶降解为各种不同大小分子量的纤维蛋白降解产物，其中含有其特异降解产物D
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二聚体。
[0003]凝血系统的激活导致凝血酶的生成，纤维蛋白原的中央结构域(E区)被凝血酶结合后，释放纤维蛋白肽A(FPA)和纤维蛋白肽B(FPB)，同时暴露出互补结合位点，以利于二者自动聚合。纤维蛋白单位通过边靠边、端靠端聚合成聚合链，生成纤维蛋白单体(FM)和多聚体。在Factor XIIIa因子和Ca
2+
的作用下，纤维蛋白单体上γ链的398或399位上的谷胺酰胺与另一个纤维蛋白单体上γ链的406位赖氨酸之间交联形成γ
’‑
γ
’
连结键，生成交联纤维蛋白。纤溶酶使DE区互补结构裂解，降解纤维蛋白原(Fg)和纤维蛋白单体(FM)，生成纤维蛋白原降解产物(Fg DPs)；同时降交联纤维蛋白，生成多种交联纤维蛋白的降解产物(Fb DPs)，其中即包含有D
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二聚体和其它片段。
[0004]D
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二聚体含量升高可检测多种疾病的病程，如深静脉血栓、弥漫性血管内凝血、心肌梗死、重症肝炎、肺栓塞等疾病；对先兆子痫和妊高危征产妇可能发生的并发症有一定的监测作用。另外，D
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二聚体水平的变化可作为监测溶栓治疗，指导溶栓药物用量的指标。由此可见，血液中D
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二聚体含量检测对血栓性疾病的早期诊断、病程监测及对溶栓药物的治疗监测等方面具有重要的临床意义。
[0005]目前主流的D
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二聚体检验方法主要有三种：全血凝集法、酶联免疫吸附(ELISA)&酶联免疫荧光(ELFA)、乳胶免疫比浊法。其中，胶乳免疫比浊法以灵敏度高、检测快速、准确的优点而被广泛应用于临床中。胶乳免疫比浊法因其敏感度高、检测快速、准确的优点，而被广泛应用于临床中。胶乳免疫比浊法检测D
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二聚体主要是基于检测物D
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二聚体与包被于胶乳颗粒表面的抗体结合，引起浊度的增加，从而实现对D
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二聚体的检测。但目前检测DD的试剂盒具有精密度低、线性范围窄、抗干扰能力弱、稳定性差的问题，限制了其在临床检测中的应用。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供D
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二聚体检测试剂盒及其检测方法。
[0007]本专利技术提供一种D
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二聚体检测的试剂盒，其包括试剂R1和试剂R2，
[0008]所述试剂R1包括：缓冲液、无机盐、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和保护剂；所述表面活性剂包括：有机硅表面活性剂、氟表面活性剂和/或非离子表面活性剂中的至少一种；
300和2g/L BSA；所述试剂R2包括：20mM HEPES缓冲液、5g/L BSA、80g/L葡萄糖和1.25mg/mL包被D
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Dimer抗体的聚苯乙烯乳胶微球。
[0033]本专利技术所述的试剂盒中，试剂R1中表面活性剂为高效有机硅表面活性剂Silwet L
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7600和非离子表面活性剂100(聚乙二醇辛基苯基醚)(Triton X
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100)两者的组合。有机硅表面活性剂不仅有比普通表面活性剂更高的表面活性(如更低的cmc和γcmc)，而且具备很多普通表面活性剂不具备的性能。表面活性剂在试剂R1中起到一个分散剂的作用，使得抗原位点暴露更加充分，从而促进待测物D
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二聚体与D
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二聚体抗体的胶乳颗粒之间的相互吸引而结合。有效的解决试剂在低值重复性差的问题，提高了试剂检测的准确度，并且试剂的抗干扰能力明显增强。
[0034]在本专利技术中，R1中表面活性剂还能有效解决试剂重复性问题。一些具体实施例中，R1试剂的表面活性剂优选为高效有机硅表面活性剂Silwet L
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7600和传统表面活性剂100(聚乙二醇辛基苯基醚)(Triton X
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100)两者的结合。一方面，R1试剂的缓冲液与上述表面活性剂的配合能有效解决试剂重复性问题。一些具体实验组中，R1试剂的缓冲液优选为pH 6.5的50mM PB缓冲液。另一方面，R1中表面活性剂剂和其他组分存在的条件下添加氯化钠，试剂的抗干扰能力进一步增强。
[0035]本专利技术试剂盒基于免疫比浊法测定D
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二聚体，检测原理为：试剂R2和样本中D
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二聚体相结合发生凝集反应后，形成抗原抗体免疫复合物，并产生浊度，该浊度的高低与样本中D
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二聚体的浓度相关，测定此时的吸光度值，根据校准曲线计算出D
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二聚体的含量。通常情况下，聚苯乙烯乳胶微球的粒径影响试剂的灵敏度。所述聚苯乙烯乳胶微球，粒径为270nm～400nm；在一些具体实施方案中，所述聚苯乙烯乳胶微球粒径为300nm。
[0036]本专利技术提供了D
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二聚体的检测方法，其利用本专利技术所述的试剂盒对样品进行检测。
[0037]进一步的，所述检测包括如下步骤：样品依次与试剂R1和试剂R2混合后，获得初始吸光度和测定吸光度的差值，根据标准曲线获得所述D
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二聚体的浓度。
[0038]更进一步的，
[0039]所述样品、试剂R1和试剂R2的体积比为150:50:6。
[0040]所述初始吸光度在试剂R2混合后的5min时测定；
[0041]所述测定吸光度在试剂R2混合后的10min时测定。
[0042]所述样品为血浆，所述血浆经过枸橼酸钠处理。
[0043]具体地，先将试剂R1与待测枸橼酸钠抗凝血浆样本混匀5分钟，然后加入试剂R2开始反应，其中，按体积比计，试剂R1:试剂R2:样本＝150:50:6；5分钟时比照空白测定初始吸光度A1，然后在10分钟时比照空白测定吸光度A2，计算A2与A1的差值ΔA，根据标准曲线获得待测血浆样本中D
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二聚体的含量。
[0044]本专利技术提供了D
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二聚体检测试剂盒，所述试剂盒由试剂R1和试剂R2组成。其中R1试剂主要由缓冲液、防腐剂、无机盐、表面活性剂、蛋白稳定剂组成；R2胶乳试剂是主要由缓冲液、蛋白保护剂、蔗糖、防腐剂组成。实验表明，该试剂盒不仅易于操作、分析时间短，而且该本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.D
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二聚体检测的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：缓冲液、无机盐、促凝剂、表面活性剂、防腐剂和保护剂；所述表面活性剂包括：有机硅表面活性剂、氟表面活性剂和/或非离子表面活性剂中的至少一种；所述试剂R2包括：缓冲液、保护剂、稳定剂和包被D
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Dimer抗体的胶乳微球；所述乳胶微球的材质为聚苯乙烯乳胶微球，粒径为300nm。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂R1中，所述缓冲液选自MOPS缓冲液和/或PB缓冲液中的至少一种；所述无机盐选自NaCl和/或KCl中的至少一种；所述促凝剂选自PEG6000和/或PEG8000中的至少一种；所述表面活性剂包括Silwet L
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7600和Triton X
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100；所述防腐剂为ProClin 300；所述保护剂选自BSA、Casein和/或ADP中的至少一种。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂R2中，所述缓冲液选自MOPS缓冲液、TAPS缓冲液、PB缓冲液、甘氨酸缓冲液和/或HEPES缓冲液中的至少一种；所述保护剂选自BSA、Casein和/或ADP中的至少一种；所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖、甘油和/或葡萄糖的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包括：pH 6.5 50mM的PB缓冲液、9～15g/L NaCl、8～10g/LPEG6000、1.0～2.0g/L Silwet L
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7600、1.0～5.0g/L Trit...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翠杰，
申请(专利权)人：北京安图生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：